1.1.2. История изобретения агарозного гель электрофореза
Несмотря на то, что метод разделения заряженных частиц под действием внешнего электрического поля был известен ещё с 1807 года, его применение для анализа нуклеиновых кислот началось лишь в 1960-х годах XX века.
Первые попытки применения электрофореза для анализа ДНК
Идея использовать электрофорез для анализа ДНК принадлежит биохимику и вирусологу Вину Торну (Vin Thorne), работавшему в середине 1960-х годов в Институте вирусологии в Глазго. Торн занимался изучением структур ДНК, выделенных из очищенных частиц полиомавируса. Он предположил, что комбинация силы трения и электрического поля позволит разделить молекулы ДНК, различающиеся по форме или размеру. Свою гипотезу он подтвердил экспериментально, используя радиоактивно меченую ДНК полиомавируса (Thorne 1966, 1967). Однако работы Торна оставались малоизвестными в научных кругах вплоть до 1970-х годов, когда открытие рестрикционных ферментов упростило анализ крупных фрагментов ДНК, а применение бромистого этидия позволило детектировать молекулы без радиоактивных меток.
Гель-электрофорез и рестриктазы
В декабре 1971 года сотрудники Университета Джонса Хопкинса Кэтлин Данна и Дэниел Натанс (Danna and Nathans) опубликовали в журнале PNAS статью, в которой впервые описали механизм действия рестрикционной эндонуклеазы на ДНК обезьяньего полиомавируса SV40 (Roberts RJ. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Apr 26;102(17):5905-8. doi: 10.1073/pnas.0500923102. Epub 2005 Apr 19. PMID: 15840723; PMCID: PMC1087929). Помимо характеристики рестриктаз, учёные продемонстрировали, что радиоактивно меченые фрагменты ДНК могут быть разделены и проанализированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Именно поэтому Данна и Натанс считаются основоположниками использования электрофореза в молекулярной биологии (Brody JR, Kern SE. History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Anal Biochem. 2004 Oct 1;333(1):1-13. doi: 10.1016/j.ab.2004.05.054. PMID: 15351274).
Бромистый этидий в агарозном электрофорезе
До появления гель-электрофореза разделение нуклеиновых кислот по размеру осуществляли методом градиентного центрифугирования. Этот подход требовал много времени, громоздкого оборудования и значительного количества исходного материала. Как отмечал Пит Борст (Piet Borst), один из пионеров применения бромистого этидия в электрофорезе: «Мы, Борст и Аайдж (Aaij и Borst), начали использовать агарозный гель-электрофорез с бромистым этидием, когда наша ультрацентрифуга вышла из строя, и нам потребовался альтернативный метод для оценки качества митохондриальных препаратов». Парадоксально, но это открытие не принесло авторам широкой известности: Аайдж защитил диссертацию и перешёл в Центральное отделение переливания крови в Амстердаме, где до сих занимает пост директора. Сам Борст отмечал, что не планировал углубляться в изучение электрофореза, так как его медицинское образование не включало биофизику. Несмотря на мировое распространение их методики, опубликованная в 1972 году статья не стала часто цитируемой — к августу 2005 года на неё ссылались всего 189 раз (Borst P. Ethidium DNA agarose gel electrophoresis: how it started. IUBMB Life. 2005 Nov;57(11):745-7. doi: 10.1080/15216540500380855. PMID: 16511967).
Отчасти это объясняется тем, что аналогичное открытие использования бромистого этидия в агарозном электрофорезе было сделано группой Sharp et al. в 1973 году (Sharp, P. A., Sugden, B., and Sambrook, J. (1973) Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose – ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry 12, 3055 – 306).
Камеры для электрофореза: их эволюция
В период с 1972 по 1975 годы популярность агарозного электрофореза резко возросла: открывались новые рестриктазы, а исследователи картировали сайты рестрикции ДНК у различных организмов. В качестве матриц использовали не только полиакриламид и агарозу, но также агар и композитные агарозно-акриламидные гели (Stellwagen NC. Electrophoresis of DNA in agarose gels, polyacrylamide gels and in free solution. Electrophoresis. 2009 Jun;30 Suppl 1(Suppl 1):S188-95. doi: 10.1002/elps.200900052. PMID: 19517510; PMCID: PMC2757927). Первоначально гели заливали в обрезанные стеклянные пипетки и помещали в вертикальные камеры, подключённые к самодельным блокам питания. Каждый образец ДНК анализировали на отдельном цилиндрическом геле.
Первый современный аппарат для электрофореза разработал Уолтер Шаффнер (Walter Schaffner), аспирант из Цюриха. Осознав, что электрическое сопротивление агарозного геля сопоставимо с сопротивлением буферного раствора, Шаффнер создал горизонтальные камеры, позволяющие анализировать более десятка образцов одновременно. Он бесплатно распространял чертежи устройства среди коллег. После того как скепсис относительно работоспособности его конструкции был преодолён, стеклянные трубки с гелями быстро вышли из употребления, а новые камеры стали неотъемлемой частью лабораторий (Michael R. Green and Joseph Sambrook/ Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis// Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top100388).
Однако первые коммерческие устройства для электрофореза появились только в 1990-х годах.
Современное состояние
Технология электрофореза сохранила свою основу практически неизменной до наших дней, хотя метод непрерывно совершенствовался, становясь быстрее и удобнее. Сегодня доступны современные более эффективные красители, таблетированные формы агарозы, компактные трансиллюминаторы не излучающие вредный для оператора и исследуемой ДНК ультрафиолетовый свет и камеры любых размеров, что значительно упрощает рутинные задачи исследователей.