1.2.1. Агароза. Основные свойства и типы

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле является наиболее эффективным методом для разделения широкого спектра фрагментов ДНК, длина которых варьируется от 100 пар нуклеотидов (п.н.) — или даже 20 п.н. при использовании агарозы с высоким разрешением — до 25 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Агароза, ключевой компонент таких гелей, представляет собой линейный полисахарид, извлекаемый из морских водорослей родов Gelidium и Gracilaria. Её химическая структура образована повторяющимися димерными единицами: 1,3-связанной β-D-галактопиранозой и 1,4-связанной 3,6-ангидро-α-L-галактопиранозой, формирующими длинные цепи (структурная формула представлена на рисунке 1). Эти цепи объединяются в двойные спиральные волокна, которые, в свою очередь, образуют суперспиральные структуры радиусом 20–30 нм благодаря водородным связям (Dr. Marcella Chiari; Pier Giorgio Righetti (1995). New types of separation matrices for electrophoresis, 16(1), 1815–1829. doi:10.1002/elps.11501601300). Наглядное изображение структуры агарозы можно увидеть на рисунке 1.

Формирование геля и его свойства
Способность агарозы к гелеобразованию обусловлена образованием нековалентных водородных связей между её полимерными цепями, что приводит к формированию пористой структуры с размерами пор от 50 до 200 нм и более. Процесс приготовления геля включает подогрев агарозы в буферном растворе с последующим охлаждением. Простота и скорость приготовления агарозных гелей делают их основным инструментом для электрофоретического разделения ДНК.

На рисунке 2 показана микрофотография пористой структуры агарозного монолита, демонстрирующая особенности его организации.

Ключевые параметры выбора агарозы

Для верного выбора агарозы под свои приложения необходимо ориентироваться на такие показатели, как: температура гелеобразования и плавления, электроэндосмос и прочность геля. Выбор типа агарозы также зависит от размера анализируемых фрагментов ДНК и последующих манипуляций, которые необходимо будет с ними выполнить. (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278). В большинстве случае концентрация агарозы колеблется между 0.5-2% — чем выше концентрация, тем меньше размер пор.

Прочность геля

Прочность геля: детали и зависимости
Прочность геля измеряется как максимальная нагрузка (в г/см²), которую выдерживает участок геля площадью 1 см² до разрушения. Этот параметр тесно связан с молекулярной массой агарозы, которая у коммерчески доступных продуктов варьируется в диапазоне 100 000–300 000 Да. Чем выше молекулярная масса, тем больше перекрёстных связей формируется между цепями, что увеличивает эластичность и прочность геля. (Dr. Francis H. Kirkpatrick; Maxine M. Dumais; Hugh W. White; Kenneth B. Guiseley (1993). Influence of the agarose matrix in pulsed-field electrophoresis. , 14(1), 349–354. doi:10.1002/elps.1150140159; Normand, Valéry; Lootens, Didier L.; Amici, Eleonora; Plucknett, Kevin P.; Aymard, Pierre. (2000). New Insight into Agarose Gel Mechanical Properties. , 1(4), 730–738. doi:10.1021/bm005583j).

Прочность геля также сильно зависит от его концентрации. Эта зависимость показана на рисунке 3 для различных типов агарозы.

Среди коммерческих типов агароз выделяют:

• Гидроксиэтилированные — образуют гели с низкой прочностью и пониженными температурами плавления.
• Немодифицированные — стандартные гели для рутинных задач.
• Высокопрочные (high gel strength) — рекомендованы для крупных фрагментов ДНК (свыше 1000 п.н.), хромосом и надмолекулярных комплексов.

Высокая прочность геля снижает риск его повреждения при манипуляциях

Электроэндоосмос

Электроосмос (electroosmosis, EEO) — это перенос жидкости, возникающий при проведении электрофореза в заряженной среде. Он является одной из основных проблем агарозного электрофореза: волокна геля несут отрицательный заряд, а положительные противоионы буфера, обеспечивающие электронейтральность, мигрируют к катоду во время электрофореза. Из-за потока EEO наблюдаемая электрофоретическая подвижность молекулы в агарозном геле представляет собой сумму её истинной подвижности и подвижности растворителя, вызванной EEO.

Значение EEO служит индикатором количества отрицательно заряженных групп в агарозе (например, сульфатов, пируватов на её цепях). Эти группы взаимодействуют с катионами буфера, снижая эффективность и разрешение разделения нуклеиновых кислот.

При рутинном электрофорезе нуклеиновых кислот уровень электроосмоса не критичен — достаточно использовать агарозу с низким или сверхнизким EEO (Dr. Francis H. Kirkpatrick; Maxine M. Dumais; Hugh W. White; Kenneth B. Guiseley (1993). Influence of the agarose matrix in pulsed-field electrophoresis. , 14(1), 349–354. doi:10.1002/elps.1150140159). Однако агарозу с «нулевым» EEO, заявленным производителем, применять не рекомендуется: она химически модифицирована — в неё добавлены положительно заряженные группы, нейтрализующие сульфатированные полисахариды. Это может ингибировать последующие ферментативные реакции (Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.top100388. PMID: 30602561.).

При работе с объектами, отличными от нуклеиновых кислот (например, белками), эффект EEO может существенно искажать результаты (Food Protected Designation of Origin. Helmut K. Mayer, Gregor Fiechter, in Comprehensive Analytical Chemistry, 2013).

Температура гелеобразования и плавления

Процесс гелеобразования агарозы начинается уже при температуре ниже 35°C (Zhang et al., 2011, doi:10.1016/B978-0-08-088504-9.00219-1), что позволяет получать гели при комнатной температуре. Для низкопроцентных гелей или сортов с пониженной температурой гелеобразования рекомендуется охлаждение до +4°C для повышения прочности (Lee et al., 2012, doi:10.3791/3923).

Температура плавления стандартной агарозы составляет 80–95°C, но существуют модифицированные варианты, например, легкоплавкая агароза (65°C), которая остаётся жидкой при 37°C и застывает при 25°C (Генетика. Энциклопедический словарь, 2011). Такие гели удобны для выделения ДНК без денатурации, что критично для клонирования или секвенирования.

Типы агароз и их применение

Агароза общего назначения (standard molecular biology (MB) grade agarose) — агароза, применяемая для рутинных молекулярно-генетических исследований: электрофореза нуклеиновых кислот (фрагменты 100 п.н. — 25 тыс. п.н.) и работы с белками. Обладает низким ЕЕО, не содержит активности РНКаз и ДНКаз. Примерные характеристики стандартной агарозы:

• Прочность геля (1%): ≥1200 г/см²;
• Температура гелеобразования: 36±1.5°C;
• Температура плавления: 80–95°C.

Параметры могут различаться у разных производителей, поэтому перед использованием необходимо сверяться с характеристиками конкретного продукта.

Легкоплавкая агароза (low melting point agarose, LE) — агароза, плавящаяся при 65°C, остающаяся жидкой при 37°C и затвердевающая при 25°C (Генетика. Энциклопедический словарь. Минск: Белорусская наука. Картель Н. А., Макеева Е. Н., Мезенко А. М., 2011). Её получают путём гидроксиэтилирования, которое снижает плотность упаковки агарозных пучков, уменьшая размер пор. В результате фрагменты ДНК того же размера мигрируют через легкоплавкий гель медленнее, чем через стандартный. Благодаря нековалентным связям между пучками гель можно повторно расплавить после застывания (Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y., Kim, Y.H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).

Гели из легкоплавкой агарозы менее прочные, но более прозрачные по сравнению с обычными агарозными гелями (https://hamptonresearch.com/).

Легкоплавкую агарозу используют, когда требуется извлечение нуклеиновых кислот из геля без денатурации (например, перед клонированием, рестрикцией, лигированием или секвенированием ДНК). Поэтому такие продукты обладают минимальной фоновой флуоресценцией и не содержат ДНКаз/РНКаз. Кроме низкой температуры плавления, гелеобразование у них также происходит при пониженных температурах (Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.top100388. PMID: 30602561.).

Агароза с высоким уровнем разрешения (AGAROSE FOR HIGH DNA RESOLUTION) — высококачественная агароза, предназначенная для разделения небольших фрагментов нуклеиновых кислот и продуктов ПЦР размером от 20 до 1000 п.н. Высокое разрешение достигается за счёт использования агарозы с высокой молекулярной массой и крайне низким содержанием сульфатов, которая образует гель повышенной прочности с низким электроосмосом (EEO) (EXCLU-SIEVE® Agarose Applications (nestgrp.com)).

Причины высокого разрешения:

• Высокая молекулярная масса агарозы;
• Минимальное содержание сульфатов;
• Плотная гелевая структура.

Благодаря улучшенному разрешению такая агароза эффективно разделяет фрагменты, различающиеся по массе всего на 2%, что делает её альтернативой полиакриламидному электрофорезу. Гели на её основе сохраняют высокую прозрачность даже при концентрациях до 5%. Температуры гелеобразования и плавления у этого типа агарозы выше, чем у легкоплавкой.

Разделение фрагментов ДНК за пределами стандартного электрофореза

Для разделения фрагментов ДНК длиннее 25 kb традиционный электрофорез в агарозном геле не подходит. В таких случаях используют электрофорез импульсного поля в агарозном геле (pulsed-field agarose gels), позволяющий разделять фрагменты размером от ∼10 до более 2000 kb. Метод основан на подаче переменного тока с двух различных направлений, что приводит к разделению крупных фрагментов ДНК по скорости их переориентации при смене направления электрического поля.

Фрагменты ДНК размером менее 100 п.н. эффективнее разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. 2012 Apr 20;(62):3923. doi: 10.3791/3923. PMID: 22546956; PMCID: PMC4846332). В то же время на рынке представлены сорта агарозы с высоким разрешением, которые также обеспечивают эффективное разделение коротких фрагментов длиной до 20 нуклеотидов.