1.2.2. Буферы для агарозного гель-электрофореза: сравнительная характеристика, приготовление и практическое применение

В статье рассматриваются основные аспекты применения буферных систем в агарозном гель-электрофорезе. Освещаются функции буфера, практические вопросы его использования, включая заполнение камеры и признаки истощения. Проводится сравнение буферов TAE и TBE, их влияния на подвижность и разделение ДНК, а также областей применения. Представлены альтернативные буферы SB и LB. Приводятся протоколы приготовления и условия хранения растворов.

Компания APGENA GENOMICA предоставляет комплексные решения для агарозного гель-электрофореза, включая современные реактивы (высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые агарозные гели, буферные системы) и оборудование. В частности, системы SuperRay предназначены как для высокочувствительного гель-документирования, так и для препаративного выделения нуклеиновых кислот из геля. С подробным описанием продукции можно ознакомиться в нашем каталоге.

Введение

Буфер для электрофореза — это солевой раствор, обладающий буферной ёмкостью. Его функция заключается в обеспечении прохождения электрического тока и предотвращении нежелательных изменений pH.

Во время электрофореза вода подвергается электролизу, что приводит к образованию газообразных водорода и кислорода. Это вызывает появление пузырьков у электродов, что служит характерным признаком протекания процесса. На аноде накапливаются протоны (H⁺), создавая кислую среду, а на катоде — гидроксильные ионы (OH⁻), создавая щелочную среду. Таким образом, катодный конец камеры имеет тенденцию становится основным (щелочным), а анодный — кислым. Поэтому для обеспечения стабильного движения и чёткого разделения заряженных частиц необходимо использовать буферную систему, которая поддерживает pH в узком оптимальном диапазоне на протяжении всего эксперимента (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278). Кроме всего прочего, слабощелочной pH буферов для электрофореза обеспечивает отрицательный заряд сахарофосфатного остова ДНК. Поэтому ДНК двигается при проведении электрофореза от отрицательного электрода к положительному.

Для обеспечения высокого качества стандартного агарозного электрофореза критически важно, чтобы буфер, использованный для приготовления геля, и буфер в камере для электрофореза были идентичными. Рекомендуется применять один и тот же буферный раствор (желательно из одной партии) и одинаковой рабочей концентрации (например, 1х).

Глубина заполнения камеры буфером

Объём буфера должен быть достаточным для заполнения электрофоретической камеры и приготовления геля.

При работе с горизонтальной камерой гель должен быть покрыт слоем буфера толщиной не более 3–5 мм, независимо от типа используемого буфера. Избыточное количество буфера приведёт к снижению подвижности ДНК, искажению полос и перегреву системы. Недостаточный уровень буфера может вызвать высыхание геля во время электрофореза (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278).

Истощение буфера

Скорость истощения буфера зависит от его типа и буферной ёмкости. Признаками истощения являются плавление геля, размазывание ДНК-полос и/или перегрев системы. Как уже отмечалось, буферная ёмкость TBE выше, чем у TAE, поэтому TBE более устойчив к истощению. Например, стандартная камера для электрофореза размером 15×30 см и объёмом 1,5–2 л может работать до 40–50 Вт·ч, прежде чем буфер истощится. Точные характеристики для конкретной модели камеры можно уточнить у производителя оборудования (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278).

Наиболее часто используемые буферы

Чаще всего для электрофореза в агарозном геле используют два типа буферов: трис-ацетатный (TAE) или трис-боратный (TBE), которые отличаются по составу. TAE-буфер содержит трис-ацетат, а TBE-буфер — трис-борат. И TBE, и TAE буферы содержат ЭДТА. ЭДТА предотвращает деградацию нуклеиновых кислот нуклеазами. Нуклеазы могут случайно загрязнить ваш образец нуклеиновой кислоты. ЭДТА ингибирует активность этих ферментов и защищает ваш образец от деградации даже в случае такого загрязнения.

TAE буфер является универсальным, поэтому в агарозном электрофорезе применяется чаще чем TBE буфер. Его можно использовать как для аналитического, так и для препаративного электрофореза. TBE рекомендуется исключительно для аналитического электрофореза, поскольку содержащийся в нём борат (в отличии от ацетата входящего в состав TAE буфера) снижает эффективность выделения ДНК из геля. Кроме того, борат ингибирует активность ферментов, например лигаз, что затрудняет последующие манипуляции с выделенной ДНК, включая клонирование.

Подвижность ДНК в TAE-буфере несколько выше, чем в TBE (рис. 1). В то же время TBE-буфер обладает существенно более высокой буферной ёмкостью, меньше нагревается во время электрофореза и поэтому он предпочтителен для длительного электрофореза при высокой напряжённости поля. Что касается разрешающей способности, TBE обеспечивает лучшее разделение фрагментов короче 3 т.п.н., но уступает TAE при разделении фрагментов длиннее 12 т.п.н.

Log10 размера ДНК(кб)
	подвижность (см)

Рисунок 1. Влияние типа буфера на подвижность молекул ДНК при агарозном гель-электрофорезе. Где по оси X обозначена подвижность в (см), а по оси Y — Log10 размера ДНК (кб)

(Asubel/ Resolution and recovery of large section ii DNA fragments. Current Protocols in Molecular Biology // 2000. — 2.5A.1-2.5A.9)

Трис—ацетатныйбуфер (ТАЕ)

Обладает высокой разрешающей способностью при работе с ДНК и РНК. Особенно хорошо подходит для электрофореза крупных фрагментов ДНК (более 12 т.п.н.). Однако его основным недостатком является низкая буферная ёмкость, поэтому он не рекомендован для высоковольтного электрофореза. При длительном проведении анализа (более 6 часов) требуется рециркуляция буфера. Состав и способ приготовления буферного раствора TAE представлены в таблице ниже.

50Х ТАЕ

Растворите Трис в 750 мл деионизированной воды, затем добавьте 0.5 M ЭДТА и ледяную уксусную кислоту. После этого доведите конечный объём раствора до 1 литра деионизированной водой. Корректировать pH данного раствора не требуется.

1Х ТАЕ

Трис-боратный буфер (ТВЕ)

Обладает значительно более высокой буферной ёмкостью по сравнению с TAE, но его не рекомендуется применять, если планируется выделение ДНК из геля для последующих экспериментов (таких как клонирование или секвенирование). При разделении фрагментов ДНК размером менее 3 т.п.н. TBE позволяет получить большее разрешение, чем TAE. Состав и способ приготовления буферного раствора приведены в таблице ниже (Asubel/ Resolution and recovery of large section ii DNA fragments. Current Protocols in Molecular Biology // 2000. — 2.5A.1-2.5A.9).

10Х ТВЕ

Растворите Трис и борную кислоту в 750 мл деионизированной воды. Добавьте 0.5 M ЭДТА. Доведите конечный объём раствора до 1 литра деионизированной водой. Корректировать значение pH этого раствора не требуется.

1Х ТВЕ

Альтернативные буферы

Помимо описанных выше «классических» буферных растворов, в молекулярной биологии также применяются альтернативные буферы, состав и свойства которых описаны ниже.

Буферный раствор бората натрия (SB), или буфер без Трис,

Буферный раствор бората натрия (SB) или буфер без Трис.

Благодаря низкой проводимости данный буфер можно использовать для электрофореза при высоком напряжении. Он обеспечивает формирование чётких полос ДНК, и фрагменты, выделенные из геля с этим буфером, пригодны для последующих экспериментов (например, клонирования или секвенирования). Однако для анализа фрагментов длиннее 5 т.п.н. SB неэффективен. Состав и способ приготовления буфера приведены в таблице ниже (Koontz L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 2013;529:35-45. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00004-5. PMID: 24011035.).

20Х SB

Растворите борную кислоту и гидроксид натрия в 950 мл деионизированной воды. Доведите финальный объем раствора до 1 л деионизованной водой. Нет необходимости корректировать рН этого раствора.

1Х SB

Буферный раствор бората лития (LB).

Похож по своим электрофоретическим свойствам на SB буфер, при этом имеет еще меньшую проводимость. В сочетании с высокопроцентной агарозой, позволяет разделять даже фрагменты с небольшими различиями в размерах. Ниже в таблице приведена информация о приготовлении буферного раствора LB (Koontz L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 2013;529:35-45. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00004-5. PMID: 24011035.).

20Х LB

Растворите борную кислоту и гидроксид лития в 950 мл деионизированной воды. Доведите финальный объем раствора до 1 л водой. Нет необходимости корректировать рН этого раствора.

1Х LB

Хранение буферов

Самостоятельно приготовленный буферный раствор для электрофореза можно хранить при комнатной температуре (18–25 °C) в течение одной недели или при температуре 2–8 °C до одного месяца (Метод электрофореза ДНК в агарозном геле. — ОФС.1.7.2.0039.18. — Общая фармакопейная статья. — Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание.— М.: 2018 год).