1.5.1. Типичные проблемы при проведении агарозного гель-электрофореза, их выявление, причины возникновения и методы решения (траблшутинг)

В данной статье рассматриваются типичные проблемы, возникающие на различных этапах постановки агарозного гель-электрофореза, и предлагаются практические рекомендации по их диагностике и решению (траблшутингу). Будут разобраны такие распространённые трудности, как слабые или отсутствующие полосы, плохое разрешение фрагментов, размазывание и искривление полос, аномальная миграция ДНК и плавление геля. Понимание этих проблем и знание способов их устранения позволят исследователям повысить эффективность, воспроизводимость и качество анализа нуклеиновых кислот.

Компания APGENA GENOMICA предоставляет комплексные решения для агарозного гель-электрофореза, включая современные реактивы (высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые агарозные гели, буферные системы) и оборудование. В частности, системы SuperRay предназначены как для высокочувствительного гель-документирования, так и для препаративного выделения нуклеиновых кислот из геля. С подробным описанием продукции можно ознакомиться в нашем каталоге.

1. Слабые или отсутствующие полосы ДНК

Частые причины и решения:

• Маркер молекулярных масс хорошо виден, включая полосы, соответствующие по молекулярной массе исследуемому фрагменту:
  • Недостаточное количество или низкая концентрация ДНК в образце (Рис.1). Увеличьте количество вносимой ДНК, но не превышайте 50 нг на лунку для продуктов ПЦР.
  • Деградация ДНК. Избегайте загрязнения препаратов нуклеазами.

• В маркере молекулярных масс видны только высокомолекулярные полосы. Низкомолекулярные полосы, соответствующие исследуемому фрагменту, отсутствуют (“убежали” из геля).
  • ДНК «убежала» из геля (Рис. 2). Используйте более низкое напряжение, сократите время электрофореза или работайте с гелями с более высокой концентрацией агарозы.
• Маркер молекулярных масс не видно на геле:
  • Проблема с визуализацией.
    1. Убедитесь в правильности окрашивания (концентрация красителя, время).
    2. При пост-окрашивании дополнительно инкубируйте гель в растворе красителя.
    3. Проверьте соответствие длины волны света трансиллюминатора используемому красителю.

Рис. 1. Пример геля со слабыми полосами. Крайняя левая дорожка — маркер молекулярных масс. (Источник: Agarose Gel Electrophoresis (explorebiology.org))

Рис. 2. Пример геля, где ДНК «уплыла». Крайняя левая дорожка — маркер молекулярных масс. (Источник: Agarose Gel Electrophoresis (explorebiology.org))

2. Плохое разрешение (нечёткое разделение близких по размеру фрагментов)

• Неправильный выбор концентрации агарозы. Для крупных фрагментов используйте низкопроцентные гели, для мелких — высокопроцентные. Подробнее в статье «1.3.1 Критерии выбора концентрации агарозы для электрофоретического разделения фрагментов ДНК».
• Диффузия фрагментов. Особенно актуально для малых фрагментов при длительном электрофорезе на низком напряжении. Оптимизируйте время и напряжённость поля. Подробнее в статье «1.3.3 Напряжение при агарозном электрофорезе ДНК: физические основы, критерии выбора и типичные ошибки».

Рис. 3. Пример геля с плохим разрешением. Крайняя левая дорожка – маркер молекулярных масс. (Источник: Why does my gel have such poor resolution? | ResearchGate)

3. Размазывание полос

Возможные причины и решения:

• Перегрузка лунки по ДНК (признак — U-образные полосы). Уменьшите количество вносимой ДНК.
• Слишком высокое напряжение. Снизьте напряжённость поля до значения, не превышающего 20 В/см или ниже.
• Деградация ДНК (Рис. 5, на изображении присутствует «хвост» из фрагментов деградировавшей ДНК). Исключите загрязнение нуклеазами.
• Образец ДНК содержит избыток солей. Проведите переосаждение ДНК этанолом для очистки образца от солей.
• Образец ДНК загрязнен белками. Проведите очистку от белков фенольной экстракцией.
• Загрузка ДНК в повреждённые (разорванные) лунки. Механизм: ДНК имеет тенденцию мигрировать к границе разделения агарозы и подложки для геля (Asubel/ Resolution and recovery of large section ii DNA fragments. Current Protocols in Molecular Biology // 2000. — 2.5A.1-2.5A.9). Перед загрузкой убедитесь в том, что лунки не повреждены. Загружайте образцы аккуратно, не повреждая лунки.
• Несовместимый или неправильно приготовленный буфер для электрофореза. Следует проверить выбор буфера и корректность его приготовления.
• Неправильный выбор загрузочного буфера.

— Для одноцепочечных нуклеиновых кислот следует использовать загрузочный буфер, содержащий денатурирующий агент, и нагревать образец во избежание образования нежелательных дуплексов.

— При электрофорезе двухцепочечной ДНК необходимо избегать использования загрузочных буферов с денатурирующим агентом и нагревания образца.

Рис. 4. Пример размазывания полос. (Источник: untitled (wiley-vch.de))

Рис. 5. Пример геля с деградированной ДНК. (Источник: How to Read, Interpret and Analyze Gel Electrophoresis Results?)

4. Волнистые полосы

Возможные причины и решения:

• Остатки сухого геля прилипли к гребенке. Тщательно очищайте гребёнку после каждого использования. После застывания геля гребенку следует извлекать аккуратно, так как в этот момент может произойти деформация (вплоть до разрыва) лунок. Для уменьшения вероятности деформации перед извлечением гребёнки залейте поверхность застывшего геля небольшим количеством буфера, после извлечения гребенки удалите его.
• Слишком высокое напряжение. Снизьте напряжённость поля до значения, не превышающего 20 В/см или ниже.
• Образец ДНК содержит избыток солей. Проведите переосаждение ДНК этанолом для очистки образца от солей.

Рис. 6. Пример геля с волнистыми полосами. Крайняя левая дорожка — маркер молекулярных масс. (Источник: Agarose Gel Electrophoresis (explorebiology.org))

5. Отсутствие ожидаемых полос, маркер молекулярных масс «побежал» вверх

• Обратная полярность подключения. Если маркер «убегает» вверх от лунок, проверьте правильность подключения электродов к источнику питания (ДНК заряжена отрицательно и бежит от «минуса» к «плюсу»).

Рис. 7. Пример геля с обратной полярностью подключения. Крайняя левая дорожка — маркер молекулярных масс. (Источник: Agarose Gel Electrophoresis (explorebiology.org))

6. Задержка ДНК в лунке

Возможные причины и решения:

• Повреждение лунки во время внесения образца. Вносите образец аккуратно, не повреждая дно и стенки лунки.
• Пузыри воздуха в геле. Если во время заливки геля образовались пузыри, удалите их сразу же после заливки, пока гель еще горячий. Это можно сделать проткнув или выгнав пузырь кончиком наконечника для автоматической пипетки.
• Гребёнка была установлена или извлечена неверно:
  • Гребёнка уперлась в дно формы для заливки. Устанавливайте гребенку правильно, на расстоянии одного, полутора миллиметров от дна формы.
  • Гребенка содержала остатки геля от предыдущей заливки. Тщательно очищайте и промывайте гребенку после каждой заливки, держите ее в чистоте.
  • Лунки были порваны во время извлечения гребенки. После застывания геля гребенку следует извлекать аккуратно, так как в этот момент может произойти разрыв лунок (внутри лунки в момент извлечения гребенки формируется вакуум). Для уменьшения вероятности повреждения лунок перед извлечением гребёнки залейте поверхность застывшего геля небольшим количеством буфера, после извлечения гребенки удалите его.
  •  

Рис. 8. Пример геля с задержкой ДНК в лунках. (Источник: How to Read, Interpret and Analyze Gel Electrophoresis Results?)

7. Плавление геля во время электрофореза

Возможные причины и решения:

• При приготовлении геля в него забыли добавить соответствующий буфер в требуемой концентрации. Приготовьте гель повторно.
• Буферная емкость истощилась во время прохождения электрофореза. Для высоковольтного длительного электрофореза вместо ТАЕ следует использовать ТВЕ буфер, обладающий более высокой буферной ёмкостью
• Перегрев вызван слишком высоким напряжением электрофореза. Небольшие камеры особенно склонны к перегреву и истощению буфера. Контролируйте напряжение. При необходимости проводите электрофорез в охлаждаемом приборе или при меньшей напряжённости поля.