1.6.4. Агарозный гель-электрофорез для анализа качества геномной ДНК перед приготовлением NGS-библиотек
Статья посвящена использованию агарозного гель-электрофореза для оценки целостности и чистоты геномной ДНК перед подготовкой библиотек для секвенирования следующего поколения (NGS). В ней подробно разбирается протокол проведения анализа, интерпретация типичных результатов (деградация, загрязнение РНК и белками) и приводятся практические рекомендации по устранению выявленных проблем для получения качественных данных NGS.
1. Введение: Значение качества ДНК для секвенирования следующего поколения (NGS)
Ключом к успешному секвенированию методом NGS является качество входящего материала. Использование высокоочищенной и неповреждённой геномной ДНК на этапе подготовки библиотек критически важно для получения качественных данных. Это требование особенно актуально для платформ с длинными прочтениями, таких как PacBio и Oxford Nanopore Technologies.
2. Методы контроля качества: комплексный подход
Целостность и размер фрагментов входящей геномной ДНК традиционно оценивают с помощью агарозного гель-электрофореза. Благодаря простоте, доступности и информативности этот метод остается одним из наиболее популярных для предварительной оценки качества ДНК перед подготовкой NGS-библиотек.
Для комплексного контроля рекомендуется использовать комбинацию методов:
- Агарозный гель-электрофорез: оценка целостности и размерного распределения ДНК.
- Спектрофотометрия (NanoDrop и аналоги): определение концентрации и оценка чистоты по соотношению абсорбций (A260/A280, A260/A230).
- Флуориметрия (Qubit, Quant-iT): более точное измерение концентрации ДНК. Реже для точного измерения концентрации применяется количественная ПЦР (qPCR).
Для обеспечения максимальной надежности результатов целесообразно проводить анализ препарата ДНК всеми тремя основными методами: электрофорезом, флуориметрией и спектрофотометрией (Top 3 Sample QC steps prior to library preparation for NGS | Genohub Blog).
3. Постановка агарозного гель-электрофореза
Для оценки качества геномной ДНК перед приготовлением NGS-библиотек рекомендуется использовать 1% агарозный гель. В качестве интеркалирующего красителя предпочтительны безопасные варианты; допускается также применение бромистого этидия. Рекомендуемое количество ДНК для загрузки составляет 40–100 нг на лунку. Используемый маркер молекулярных масс должен содержать референсную полосу размером 20 тыс. пар оснований (20 т.п.н.).
Примечание: при использовании высокочувствительных систем гель-документации, таких как трансиллюминаторы SuperRay (APGENA GENOMICA, Россия) в сочетании с современными красителями (такими как SafeGreen), необходимое для визуализации количество ДНК может быть существенно снижено. Это позволяет экономить ценные образцы, особенно когда их количество ограничено.
Электрофорез проводят в 1X TAE-буфере. Вольтаж и продолжительность разделения зависят от конкретной модели электрофорезной камеры. Критерием правильно подобранных условий является миграция фрагмента размером 20 кб более чем на 2 см от лунки и четкое разделение полос маркера молекулярных масс (Genomic-DNA-QC.v3 (doe.gov); PreQC handbook-2023-v2.pdf (base-asia.com)).
4. Интерпретация результатов электрофореза
Полученное изображение геля позволяет выявить наличие или отсутствие загрязнения РНК и белками, а также оценить степень деградации образца (How should I QC my genomic DNA samples before sequencing? | DNA Technologies Core (ucdavis.edu)).
Примеры интерпретации результатов представлены на рисунках 2–7. Во всех описанных экспериментах использовался маркер молекулярных масс, изображенный ниже.
Рисунок 1. Маркер молекулярных масс использовавшихся при проведении экспериментов.
На рисунке 2 приведен пример успешного прохождения контроля качества всеми исследованными образцами ДНК.
Рисунок 2. Пример геля с образцами ДНК, имеющими четкую яркую полосу с молекулярной массой больше 23кб и минимальным шмером. Изображение взято с сайта Genomic-DNA-QC.v3 (doe.gov)
На рисунке 3 приведены образцы более низкого качества, которые, однако, были признаны авторами приемлемыми для дальнейшего анализа.
Рисунок 3. Пример геля с образцами ДНК, некоторые из которых с небольшими шмерами, но большая часть образцов имеет молекулярный вес около 23кб. Изображение взято с сайта Genomic-DNA-QC.v3 (doe.gov)
На приведенных далее электрофореграммах можно идентифицировать три основных типа проблем, влияющих на качество ДНК.
- Деградация ДНК имеет специфическую картину электрофореза, характеризующуюся выраженным «шмером» (см. рисунки 4, 5). Это связано с накоплением коротких фрагментов вследствие разрыва высокомолекулярной ДНК. В отличие от деградированных образцов, ДНК высокого качества представлена четкой компактной полосой, соответствующей крупным интактным молекулам (см. рисунок 2). Поскольку использование деградированной ДНК для подготовки NGS-библиотек приводит к снижению качества данных, при её обнаружении на этапе контроля качества рекомендуется провести повторное выделение ДНК.
Рисунок 4. Пример геля с образцами ДНК, которые содержат возрастающую от геля А к гелю C деградацию. Изображение взято с сайта PreQC handbook-2023-v2.pdf (base-asia.com)
Рисунок 5. Пример геля с образцами ДНК, часть из которых сильно деградирована, часть контаминирована РНК (выделено красным). Изображение взято с сайта Genomic-DNA-QC.v3 (doe.gov)
- РНК-контаминация проявляется в виде интенсивного диффузного «шмера» в области низкомолекулярных фрагментов (см. рисунки 4, 6). Поскольку присутствие РНК приводит к завышению спектрофотометрических показателей концентрации ДНК и может ингибировать последующие этапы подготовки библиотек, загрязненные образцы рекомендуется обработать РНКазой I не содержащей ДНКаз ((DNA sample QC for NGS (qiagen.com)).
Рисунок 6. Пример геля с образцами ДНК, которые содержат возрастающую от геля А к гелю D РНК-контаминацию. Изображение взято с сайта PreQC handbook-2023-v2.pdf (base-asia.com)
- Присутствие белков и полисахаридов также способно ингибировать ферментативные реакции при построении библиотеки (см. рисунок 7). Для устранения такого загрязнения требуется дополнительная очистка препарата или изменение протокола выделения. На геле подобные образцы могут визуально напоминать деградированную ДНК, демонстрируя смазанные полосы и «шмер». Однако свечение полос обычно слабое, так как белки маскируют интеркаляцию красителя в ДНК. Характерным признаком может быть флуоресценция выше основной полосы, вызванная присутствием высокомолекулярных белковых комплексов.
Рисунок 7. Пример геля с образцами ДНК, содержащими примеси (белки и полисахариды, способные ингибировать реакции при создании библиотек). Изображение взято с сайта Genomic-DNA-QC.v3 (doe.gov)
5. Как получить недеградированную ДНК?
На практике получение высококачественной, интактной геномной ДНК может представлять сложность. Обычно не составляет труда добиться высокой общей концентрации нуклеиновых кислот (совокупность геномной ДНК и РНК) на начальном этапе экстракции. Однако геномная ДНК часто подвергается деградации в ходе последующей обработки образцов РНКазами.
В качестве эффективного решения для получения образцов интактной геномной ДНК коллектив исследователей из Бангкока предложил методику, сочетающую препаративный электрофорез в агарозном геле с последующей очисткой на спин-колонках. Согласно протоколу, тотальную геномную ДНК, выделенную с использованием набора для выделения ДНК, разделяют методом электрофореза в стандартном 0,8–1% агарозном геле. Затем из геля вырезают полосу, соответствующую высокомолекулярной фракции интактной ДНК. Данный фрагмент геля подвергают очистке с использованием набора для экстракции ДНК из геля на спин-колонках.
Этот подход позволяет получить значительное количество высокоочищенной геномной ДНК, пригодной для NGS. Метод был успешно апробирован на различных объектах, включая диктиостелиды, бактерии и растения (Utthiya S, Wonnapinij P, Napaumpaiporn P, Kittiwongwattana C, Sakulkoo J, Suttangkakul A, Vuttipongchaikij S. Gel purification of gDNA for next-generation sequencing applications. Biotechniques. 2022 Aug;73(2):99-103. doi: 10.2144/btn-2022-0013. Epub 2022 Aug 11. PMID: 35950336.).
Примечание: для процедуры вырезания целевых полос из геля мы рекомендуем использовать системы гель-документации SuperRay (APGENA GENOMICA, Россия). Приборы комплектуются специальной доской для вырезания фрагментов геля, изготовленной из закалённого стекла, устойчивого к царапинам при работе со скальпелем. Кроме того, визуализация синим светом предотвращает индуцированные ультрафиолетом повреждения ДНК, такие как образование тиминовых димеров, обладает более высокой чувствительностью, предотвращает выгорание полос и полностью безопасна для оператора.
Для проведения агарозного гель-электрофореза, включая подбор оборудования, реагентов (агарозы, красителей) и расходных материалов, вы можете ознакомиться с продукцией компании APGENA GENOMICA. Полный ассортимент представлен в нашем каталоге.