1.4.1.3. «Невидимые лучи». Эра ионизирующего излучения в визуализации результатов электрофореза ДНК (1960–1990)

В настоящий момент идет активное замещение ультрафиолетовых трансиллюминаторов на трансиллюминаторы синего света, такие как системы SuperRay (APGENA GENOMICA, Россия), не только из соображений более высокой чувствительности систем SuperRay, но и из соображений безопасности для оператора.

На этом фоне современные молекулярные биологи вряд ли с энтузиазмом воспримут идею использования радиоактивных меток для рутинного агарозного или акриламидного электрофореза. Однако ученые, стоявшие у истоков этих методик, работали в эпоху совершенно иного отношения к радиации. Они воспринимали ее позитивно и раиоактивные методы были в то время естественным выбором (см. более подробно в главе 2).

Рисунок 1. Футуристический интерьер магазина «Изотопы» (Ленинский пр-т, 70/11), 1959 г. Снимок А. Сергеева-Васильева. В эпоху научно-технической революции атомная тематика проникла в повседневную жизнь и эстетику городов. Магазин сочетал в себе функции торговой точки и просветительского центра, став важным элементом советского модернизма и наглядной агитации за прогресс.

Первые эксперименты с радиоактивным излучением для визуализации данных электрофореза

В 1966 году в журнале Virology вышла первая публикация, посвящённая разделению ДНК методом электрофореза в агарозном геле (использовался агар). Её автор, H.V. Thorne, доказал ключевое преимущество нового метода — более высокое разрешение по сравнению с распространённым тогда методом ультрацентрифугирования. Однако, в этой публикации мы не увидим привычных электрофореграмм.

Методика эксперимента заключалась в следующем: ДНК, меченную тритием, в количестве ~1000 нг наносили в лунку 1% геля. Электрофорез проводили при напряжённости 4 В/см на протяжении трёх часов. После завершения гель разрезали скальпелем на фрагменты 0.5*2 см и измеряли в них радиоактивность. Полученные данные визуализировали в виде графика, где по оси X был отложен номер фракции, а по оси Y — радиоактивность в имп./мин.

Рисунок 2. Результаты электрофореза тотальной ДНК, меченной ³H-тимидином, экстрагированной из культур эмбриональных клеток мыши. Сравнивается ДНК из здоровых клеток (верхний ряд), клеток, инфицированных вирусом полиомы (средний ряд), и ДНК, выделенная непосредственно из очищенного вируса полиомы (нижний ряд) [H.V. Thorne, Virology 29, 234–239 (1966)].

Отсутствие в публикации привычных фотографий гелей и визуализация данных исключительно в виде графиков «радиоактивность — номер фракции» (Рисунок 2), связаны с методической инерцией. В тот период абсолютно аналогичный подход — разделение на фракции с последующим измерением радиоактивности в каждой — повсеместно, в том числе и авторами публикации, использовался для анализа результатов ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl). Поэтому авторам было естественно применить этот уже устоявшийся метод и понятное всем представления данных и к новой методике — электрофорезу в агарозном геле.

Количество ДНК (1000 нг) выбрано не из-за низкой чувствительности изотопных меток, а для практической целесообразности. Уменьшение дозы потребовало бы многократного увеличения времени измерения, сделав ручной анализ неэффективным.

Сам автор понимал несовершенство фракционного анализа для агарозного электрофореза, указав, что авторадиография могла бы значительно упростить визуализацию результатов.

Во второй знаковой для электрофореза нуклеиновых кислот публикации 1971 года «Specific Cleavage of Simian Virus 40 DNA by Restriction Endonuclease of Hemophilus Influenzae» Danna и Nathans наряду с ультрацентрифугированием (Рисунок 3) использовали и метод электрофореза для анализа нуклеиновых кислот. В отличие от H.V. Thorne, они применили не агарозный, а полиакриламидный гель, а также существенно усовершенствовали подход к визуализации. Помимо классического метода — разрезания геля на фрагменты и измерения их радиоактивности — авторы впервые для визуализации данных ДНК электрофореза применили авторадиографию.

После проведения электрофореза одну часть полиакриламидного геля разрезали на фрагменты размером 1,2 мм для точного количественного измерения радиоактивности и построения кривой распределения. Эти данные позволили рассчитать молекулярные массы и подтвердить эквимолярность основных продуктов рестрикции (Рисунок 4).

Другую часть того же геля фиксировали и подвергали авторадиографии (Рисунок 4). Авторадиография позволила увидеть все 11 дискретных фрагментов (A—K) в виде высокоразрешенных полос, а также разрешить пики, которые было сложно интерпретировать на графике, полученном путем фракционирования геля.

Таким образом, использованный авторами гибридный подход сочетал в себе точность квантификации классического количественного анализа с наглядностью и высоким разрешением новой визуализирующей методики — авторадиографии. Впоследствии процедура анализа была ещё более упрощена: количественную информацию стали получать, непосредственно измеряя оптическую плотность (яркость) полос на готовых авторадиограммах.

Рисунок 3. Результат разделения продуктов рестрикции ДНК вируса SV40 эндонуклеазой H. influenzae методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности. Метод демонстрирует расщепление исходной ДНК на фрагменты, однако не обеспечивает их достаточного разделения: все продукты рестрикции визуализируются в виде единого сливающегося пика.

Рисунок 4. Сравнение методов визуализации результатов электрофореза рестрикционных фрагментов ДНК SV40 (эндонуклеаза H. influenzae). Верхний график: профиль распределения радиоактивности, полученный путём фракционирования геля; фрагменты C/D и E/F остаются неразрешенными. Нижний рисунок — авторадиограмма с чётким разделением всех полос.

Хотелось бы отметить преимущество радиоактивных изотопов в качестве меток. Метод с использованием радиоактивных изотопов характеризовался исключительно высокой чувствительностью. Ещё в 1981 году Kopchick и соавторы в статье «Rapid analysis of small nucleic acid samples by gel electrophoresis» (Analytical Biochemistry) описали систему детекции, позволявшую выявлять всего 1 пикограмм рестрикционного фрагмента на полосу агарозного геля. Однако для достижения такой чувствительности в то время требовалась четырёхсуточная экспозиция.

Что касается аппаратной части то для анализа излучения в фракциях использовали счетчики гейгера. После чего довольно быстро перешли к рентгеновской пленке и нагатоскопам (световые столики, экраны, трансиллюминаторы белого света), которые были довольно просты в устройстве и выпускались различными фирмами (Рисунок 5). Количественные данные снимали денситометрами прямо с рентгеновской пленки (Рисунок 6).

Рисунок 5. Секвенирование ДНК (1980). Анализ результатов электрофореза в полиакриламидном геле с помощью авторадиографии. На рентгеновской пленке видны фрагменты ДНК, меченные радиоактивными изотопами. Фото: Linda Bartlett / National Cancer Institute. Public Domain.

Рисунок 6. Микроденситометр Joyce Loebl MK.III CS (1963 г.) Прибор английской компании Joyce Loebl использовался для высокоточного количественного анализа авторадиограмм агарозного и акриламидного электрофореза. Он измерял фотографическую плотность слабых линий на пленке, невидимых глазу. Это одно из последних докомпьютерных устройств для анализа изображений, позже замененное компьютерными сканирующими системами.

Эпоха ручной авторадиографии на плёнку, а также полуавтоматических денситометров для анализа этих плёнок продолжалась до 1989 года.

Появление первого автоматического прибора для экспресс-визуализации радиоактивномеченных гелей без рентгеновских пленок Molecular Dynamics 400A PhosphorImager в 1989 году стало настоящей революцией в лабораторной практике, сравнимой по значимости с переходом от ручного фракционирования геля к авторадиографии.

Модель Molecular Dynamics 400A PhosphorImager стала точкой отсчёта новой эры в визуализации гелей меченых радиоактивными метками. Для визуализации радиоактивных меток прибор использовал фосфоресцентные экраны (storage phosphor screens), которые сканировались гелий-неоновым лазером. Это и был тот самый первый прибор, который принципиально автоматизировал процесс количественного и качественного анализа радиоактивных гелей. Он был довольно громоздким. Позже появились более совершенные модели, например, PhosphorImager 425 (1991) а затем компактный компактный MOLECULAR DYNAMICS Phosphorimager 445 SI (Рисунок 7).

Рисунок 7. MOLECULAR DYNAMICS Phosphorimager 445 SI. Компактная модель, первая половина 1990х годов.

Появление таких приборов, как Phosphorimager, интегрированных с компьютером и программным обеспечением, существенно упростило и ускорило процесс визуализации результатов электрофореза в геле с применением радиоактивных меток. Это было особенно важно для секвенирования ДНК по Сэнгеру. Однако, по сути, эти приборы ознаменовали собой и конец эры радиоактивных меток в визуализации гелей.

Изменение отношения к радиации и новые методы

Кроме всего прочего, изменилось отношение общества к радиации. Поэтому уже с конца 70-х — начала 80-х годов появилась тенденция для задач, не требующих сверхвысокой чувствительности (например, рутинное ПЦР-генотипирование, рестрикционный анализ ДНК, проверка качества ампликонов перед секвенированием по Сэнгеру и др.), не использовать радиоактивные метки. Эти задачи стали решаться с помощью связки ультрафиолет-бромистый этидий. Для методик, требующих пикограммовой чувствительности, таких как SSCP, начали использовать окраску гелей серебром и визуализацию с помощью трансиллюминаторов белого света. В 90-х радиоактивность использовали только там, где не хватало чувствительности этих двух методов (в основном секвенирование по Сэнгеру и микросателлитный анализ).

Развитие флуоресцентных методов

Приборы Phosphorimager для секвенирования по Сэнгеру использовали чтение геля после прохождения электрофореза. Однако, параллельно с ними компанией Applied Biosystems развивалась сходная технология, но основанная на введении в образец флуоресцентных меток и детекции результата фореза в «реальном времени» с использованием синего лазера. Вместо того чтобы считывать гель постфактум, приборы Applied Biosystems детектировали прохождение фрагментами ДНК в узком участке геля, рисуя электрофореграммы. Позже вместо гелей стали использовать капилляры. Появились специализированные приборы для этих задач — генетические анализаторы, которые называли просто — секвенаторы. Кроме секвенирования, они взяли на себя также задачу микросателлитного анализа. По этой причине официально они назывались не секвенаторами, а генетическими анализаторами. Так, в конце 90-х — начале 2000-х годов секвенирование ДНК по Сэнгеру и микросателлитный анализ ушли из рутинных задач агарозного и полиакриламидного электрофореза.

Недостатки метода с использованием радиоактивных меток

Отличительной особенностью метода с использованием радиоактивных меток была непревзойденная чувствительность. Можно было увидеть полосы ДНК количеством менее 1 пикограмма. Однако, несмотря на чувствительность, метод имел множество недостатков, особенно при работе с агарозными гелями (p. 1):

1. Опасность для здоровья: Работа с радиоактивными метками требовала защитных экранов (рисунок 6), специально оборудованных лабораторий, как правило, изолированных от остальных площадей института в изотопный блок, строгого учета и сложных процедур утилизации. Этот фактор стал особенно важен в 1990-е годы.
2. Трудоемкость, особенно при работе вручную: При длительной экспозиции в гелях будет идти диффузия фрагментов, полосы будут расплываться. Чтобы нивелировать этот эффект, проводили высушивание геля, что превращало гель в тонкую пленку, полностью останавливая диффузию. Или использовали блоттинг на мембрану: ДНК переносили и прочно закрепляли на нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране.
3. Большие временные затраты, особенно при работе вручную: Процесс от окончания электрофореза до получения результата мог занимать от суток до нескольких недель. Можно было бы ускорить процесс с помощью Phosphorimager, однако они были слишком дороги и сложны для рутинного электрофореза.
4. Логистика и стоимость: Короткий период полураспада ³²P (14,3 дня) означал постоянную необходимость в заказе свежих реактивов и планировании экспериментов «под изотоп». Для оперативного приобретения изотопов научными организациями в Москве на Ленинском проспекте даже был открыт магазин «Изотоп» (Рисунок 1).

Рисунок 6. Современное защитное оборудование для работы с бетта — радиоактивными материалами.

Поэтому метод, хотя он используется в электрофорез даже сейчас для уникальных задач, требующих сверхвысокой чувствительности, к 2000-м годам в целом был вытеснен из визуализации данных электрофореза ДНК. Для секвенирования и фрагментного анализа — генетическими анализаторами Applied Biosystems, использующими флуоресцентные метки. Из рутинных приложений агарозного и акриламидного электрофореза (ПЦР-генотипирование, рестрикционный анализ, контроль качества ПЦР в секвенировании по Сэнгеру, скрининг колоний и т.д.) — вначале ультрафиолетовыми трансиллюминаторами/трансиллюминаторами белого света в связке с бромистым этидием/серебрением. А затем современными трансиллюминаторами синего света, такими как SuperRay (APGENA GENOMICA, Россия) в связке с современными красителями, которые вытеснили также и трудоемкое серебрение из рутинного рабочего процесса.