1.3.3. Напряжение при агарозном электрофорезе ДНК: физические основы, критерии выбора и типичные ошибки

На подвижность молекул ДНК в агарозном геле влияет множество факторов, одним из ключевых является напряжение, приложенное во время электрофореза.

Физическая основа: закон Ома, поле и сила, действующая на ДНК

Электрофорезная система описывается законом Ома:

V = I * R,

где V — напряжение (вольты), I — сила тока (амперы), R — сопротивление (омы) всей системы (гель + буфер).

Поскольку стандартные электрофорезные буферы имеют слабощелочную реакцию, фосфатные группы в сахарофосфатном остове ДНК несут отрицательный заряд. При приложении напряжения в системе возникает электрическое поле. Именно это поле действует на заряженные молекулы ДНК с силой, пропорциональной их заряду и напряжённости поля, заставляя их двигаться к аноду (+).

Напряжённость электрического поля — ключевой параметр

Интенсивность поля характеризуется его напряжённостью (E), которая рассчитывается как разность потенциалов (напряжение V), приложенная к гелю, отнесённая к расстоянию (L) между электродами:

E = V / L.

Измеряется в Вольтах на сантиметр (В/см). Именно этот параметр (В/см) является основным для воспроизводимого выбора режима электрофореза, так как он определяет силу, движущую молекулы.

Для стандартного горизонтального электрофореза при расчёте напряжённости поля принято использовать прямое расстояние между электродами (а не длину геля или сложный путь тока)

Важное практическое замечание: ключевой параметр — напряжённость поля, а не напряжение.

При планировании электрофореза распространённой ошибкой является выбор режима работы только по величине напряжения на источнике питания. Вопрос «На каком напряжении вести форез?» без учёта геометрии камеры некорректен, так как абсолютное значение напряжения (в вольтах) само по себе не определяет условий в геле.

Сравнительный пример: одно напряжение — разные условия

Рассмотрим подачу одинакового напряжения 300 В на две камеры разного размера:

Вывод: Корректная постановка вопроса — не «Какое напряжение использовать?», а «При какой напряжённости поля (В/см) проводить электрофорез?». Именно этот параметр, рассчитанный для конкретной камеры, обеспечивает воспроизводимость и качество результатов независимо от размера электрофорезной камеры.

Влияние приложенного напряжения на подвижность ДНК при агарозном гель-электрофорезе

Качественное влияние напряжения на разделение фрагментов ДНК наглядно представлено на рисунке 1

Log10 размера ДНК(кб)
	подвижность (см)

Рисунок 1. Влияние напряжения в В/см на подвижность молекул ДНК при агарозном гель-электрофорезе. Где по оси X показана подвижность (см), а по оси Y — Log₁₀ размера ДНК(кб)

(Asubel/ Resolution and recovery of large section ii DNA fragments. Current Protocols in Molecular Biology // 2000. — 2.5A.1-2.5A.9)

Оптимальный диапазон напряжённости поля и последствия его превышения

Наиболее часто для агарозного электрофореза применяют напряжённость поля в диапазоне от 1 до 10 В/см. При низких значениях, скорость миграции линейных фрагментов ДНК прямо пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряжённости электрического поля подвижность высокомолекулярных фрагментов возрастает непропорционально, что приводит к сужению эффективного диапазона разделения в агарозном геле и делает использование чрезмерно высокого напряжения нежелательным. Например, для достижения максимального разрешения фрагментов ДНК размером более 2 кб электрофорез следует проводить при напряжённости поля не выше 5–8 В/см. (Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.top100388. PMID: 30602561.). ,

Ключевые негативные последствия высокой напряжённости поля:

1. Ухудшение разрешения: очень высокое напряжение может привести к «слипанию» (плохому разделению) полос, особенно для фрагментов длиннее 12–15 кб (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambrex. P. 278).
2. Термические эффекты:
   • Нагрев геля: Электрофорез при высоком напряжении вызывает значительный нагрев геля, что может привести к его оплавлению и размыванию полос (S. Magdelin — Gel Electrophoresis — Principles and Basics [biochem] (2012, Intech ).
   • Влияние на ДНК и краситель: Повышенная температура способствует диссоциации интеркалирующего красителя (например, бромистого этидия) из ДНК, снижая чувствительность детекции (Метод электрофореза ДНК в агарозном геле. — ОФС.1.7.2.0039.18. — Общая фармакопейная статья. — Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание.- М.: 2018 год)

Таким образом, подбор оптимальной напряжённости поля является компромиссом между скоростью проведения анализа и качеством разделения.

Эффективность разделения фрагментов нуклеиновых кислот в геле, как следствие, снижается с ростом напряжённости поля. Для достижения максимального разрешения крупных фрагментов ДНК рекомендуется применять низкую напряжённость (около 1 В/см) в сочетании с низкопроцентным гелем (например, 0,5% агароза). Однако чрезмерно низкое напряжение также может привести к ухудшению качества разделения: при электрофорезе малых фрагментов ДНК (< 1 кб) оно часто вызывает образование нечётких, излишне широких полос.

На рисунке 2 представлены результаты, иллюстрирующие эту зависимость:

• Гель 1: Напряжённость поля 1 В/см, буфер 1× ТАЕ, время электрофореза — 16 часов.
• Гель 2: Напряжённость поля 5 В/см, буфер 1× TBE, время электрофореза — 2 часа 10 минут.

Как видно на изображении, при напряжённости 1 В/см короткие фрагменты дают полосы с размытыми краями, в то время как при 5 В/см формируются чёткие, хорошо разрешённые полосы для фрагментов всех размеров.
(Источник: A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P. 278).

Рисунок 2. Результаты разделения фрагментов ДНК в 3% агарозном геле. На дорожке А ДНК бактериофага φX174 обработанная ферментом Нае III. На дорожке В плазмида pBR322, обработанная ферментом Msp I . Гель 1 — 1 В/см, гель 2 — 5 В/см

Следовательно, для достижения желаемых результатов электрофореза необходимо корректно подобрать параметры. В таблице 1 приведены оптимальные значения напряжённости поля и рекомендуемые буферные системы для анализа фрагментов ДНК различного размера, в зависимости от цели исследования (препаративной или аналитической).

Таблица 1. Рекомендуемые условия для проведения агарозного электрофореза ДНК

(Источник: A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P. 278)

*Для некоторых специальных разновидностей высокоразрешающих гелей рекомендовано использовать TAE буфер (APGENA GENOMICA)

Для проведения агарозного гель-электрофореза, включая подбор оборудования, реагентов (агарозы, красителей) и расходных материалов, вы можете ознакомиться с продукцией компании APGENA GENOMICA. Полный ассортимент представлен в нашем каталоге.