1.6.1. Диагностика (траблшутинг) проблем ПЦР и qPCR методом агарозного гель-электрофореза
При неудовлетворительном результате полимеразной цепной реакции (ПЦР), как классической, так и в режиме реального времени (qPCR), стандартным методом диагностики причины неудачи и последующей оптимизации условий является анализ электрофореграмм, полученных с помощью агарозного гель-электрофореза.
Ниже представлены наиболее типичные проблемы, возникающие при проведении ПЦР. Они сгруппированы в соответствии с их визуальным проявлением при анализе продуктов амплификации в агарозном геле – отсутствие полос, слабые целевые полосы, неспецифические продукты, шмеры, димеры праймеров. Для каждого типа проблем предлагаются возможные пути решения.
Компания APGENA GENOMICA предоставляет комплексные решения для агарозного гель-электрофореза, включая современные реактивы (высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые агарозные гели, буферные системы) и оборудование. В частности, системы SuperRay предназначены как для высокочувствительного гель-документирования, так и для препаративного выделения нуклеиновых кислот из геля. С подробным описанием продукции можно ознакомиться в нашем каталоге.
А. Отсутствие целевых полос или наличие крайне слабых целевых полос
(Полосы маркера молекулярных масс при этом визуализируются нормально)
| Возможная причина | Решение |
| Некорректная работа термоциклера | Если при постановке ПЦР не использовался положительный контроль, для проверки работоспособности прибора необходимо провести контрольный эксперимент. Используйте коммерчески доступную контрольную ДНК-матрицу и заведомо работоспособные реактивы (готовую смесь для ПЦР и праймеры). Протокол валидации: |
| Некорректный выбор пластика (пробирок, планшетов, стрипов). | Для эффективного термоциклирования пластик должен плотно прилегать к лункам термоциклера, обеспечивая непосредственную теплопередачу. Неподходящая форма пластика создаёт воздушную прослойку между термоблоком и пробиркой, что негативно сказывается на точности контроля температуры. Используйте пробирки или планшеты, рекомендованные производителем вашего термоциклера. |
| Недостаточное количество циклов амплификации. | Используйте большее количество циклов. Обычно рекомендуется использовать от 20 до 35 циклов. Если концентрация ДНК-мишени низкая — требуется больше циклов, если высокая — меньше. |
| В реакцию было внесено недостаточное или избыточное количество матричной ДНК. | Проведите титрование матричной ДНК для определения её оптимального количества в рамках используемой тест-системы. Если увеличение количества вносимой ДНК невозможно, подберите оптимальное число циклов амплификации. Для этого проведите серию экспериментов, последовательно увеличивая количество циклов с шагом в 5. |
| Низкое качество препарата ДНК или наличие в нём ингибиторов | Используйте свежевыделенную ДНК или проведите выделение другим методом/набором реагентов. При подозрении на наличие ингибиторов — разбавьте препарат ДНК. Если проблема была в ингибиторах, их концентрация снизится, что может существенно увеличить эффективность ПЦР и привести к появлению целевых полос в геле. Для подтверждения присутствия ингибиторов можно поставить контрольную реакцию. В такую реакцию вносят высокоочищенную контрольную плазмиду и, соответственно, праймеры для ее амплификации. А также, в качестве «балласта», — объем тестируемого препарата ДНК, который использовался в ПЦР, которая не прошла. Угнетение амплификации контрольной плазмиды будет свидетельствовать о наличии ингибиторов в исследуемом образце. |
| Концентрация праймеров слишком низкая или несбалансированная | Убедитесь, что концентрация праймеров попадает в рекомендуемый диапазон (0,2–1 мкМ в конечной реакции) и концентрация обоих ПЦР праймеров одинакова |
| В реакционную смесь случайно попали нуклеазы | Подготовьте образцы заново. Обязательно соблюдайте меры предосторожности, чтобы нуклеазы не попали в реакционную смесь. Это особенно важно при работе с РНК |
| Для РНК: матрица находилась в буфере с ЭДТА | ЭДТА, присутствующий в растворе РНК, хелатирует ионы Mg2+, необходимые для успешного прохождения RT-PCR, что может привести к неоптимальным результатам. Чтобы компенсировать это, при постановке реакции добавьте дополнительное количество Mg2+. |
| Слишком низкая/высокая концентрация dNTP | Каждый dNTP должен присутствовать в конечной реакции в концентрации 200 мкМ |
| Перед постановкой реакции реагенты не были полностью разморожены/перемешаны | Полностью размораживайте и тщательно перемешивайте реагенты перед постановкой реакции |
| Слишком низкая концентрация фермента | Увеличьте концентрацию фермента. Его концентрация зависит от длины и сложности амплифицируемой мишени |
| Неверный дизайн праймеров | Проверьте, соответствуют ли последовательности праймеров целевой ДНК-мишени. Используйте специализированное программное обеспечение для дизайна и проверки праймеров. Программа поможет выявить и избежать проблем, таких как повторы последовательностей, высокая само- или межпраймерная комплементарность, наличие полиморфизмов в сайте отжига. Проведите анализ специфичности праймеров с помощью поиска по базе данных (например, BLAST), чтобы убедиться в отсутствии амплификации псевдогенов или незапланированных геномных локусов. |
| Недостаток или отсутствие ионов Mg2+ | Используйте концентрацию 1.5 мМ в финальной реакции |
| Неоптимальная температура денатурации | Попробуйте увеличить температуру или продолжительность начальной стадии денатурации (как правило, оптимальная температура денатурации равна 95°C). Это особенно актуально для GC-богатых последовательностей. |
| Слишком длительное или недостаточное время денатурации | Как правило, хорошо работает следующая температура/длительность денатурации: первоначальная денатурация — 3 мин при 95°C; денатурация в цикле — 30 секунд при 95°C. |
| Слишком высокая температура отжига | Оптимальная температура отжига, как правило, должна быть примерно на 5°C ниже температуры плавления (Tm) используемого праймера. Рассчитайте Tm каждого праймера, например, с помощью онлайн-калькулятора. Для определения температуры отжига пары праймеров используйте значение Tm праймера с наименьшим показателем из пары. Для большей точности оптимизируйте температуру отжига, например, используя температурный градиент или термоциклер с независимыми термоблоками. Если рассчитанная температура (Tm — 5°C) оказывается близка к температуре элонгации (72°C), попробуйте перейти к протоколу двухэтапной ПЦР. Важно помнить, что температура отжига не должна превышать температуру элонгации. |
| Слишком короткое время отжига | Установите время отжига продолжительностью как минимум 30 секунд |
| Недостаточное время элонгации | Увеличьте время элонгации, исходя из пропорции: 1 минута на каждые 1000 пар нуклеотидов длины ампликона (рекомендация для Taq-полимеразы). Для других полимераз оптимальное время элонгации может отличаться. |
| ПЦР-продукт с высоким содержанием GC | GC-богатые последовательности как правило трудно амплифицировать. Увеличьте температуру отжига (для большей точности подберите температуру отжига с использованием градиента температур). Можно добавить ДМСО или другой дестабилизатор вторичной структуры (не более 10%). |
| Слишком длинная мишень | Концентрации компонентов ПЦР и/или условия реакции могут оказаться неподходящими для длинных последовательностей. Повторно оптимизируйте существующий протокол реакции и/или увеличьте продолжительность этапов ПЦР, особенно этапа элонгации. |
| Амплификатор поддерживает неверную температуру полок во время термоциклирования | Отремонтируйте/откалибруйте термоциклер либо воспользуйтесь другим прибором |
Б. Неспецифичные полосы на геле
| Возможная причина | Решение |
| Праймеры гибридизовались со вторичным сайтом отжига на матрице | Разработайте другие праймеры, обладающие меньшей специфичностью ко вторичному сайту посадки. Повысьте температуру отжига. Для подбора оптимальной температуры проведите серию ПЦР-экспериментов, увеличивая температуру отжига с шагом от 2 °C до 5 °C между экспериментальными точками. |
| Вода, праймеры, буфер или dNTP были загрязнены или ненадлежащего качества | Всегда включайте в эксперимент отрицательный контроль (реакцию без матричной ДНК). При обнаружении в нём продукта амплификации необходимо заменить все реактивы. Недостаточно очищенные праймеры могут ингибировать ПЦР и способствовать образованию неспецифических продуктов. Рекомендуется использовать обессоленные праймеры или праймеры более высокой степени очистки. Для проверки наличия ингибирующего эффекта можно попробовать разбавить рабочий раствор праймеров. Однако конечная концентрация каждого праймера в реакции не должна быть ниже 0,02 мкМ. Разбавление служит лишь для диагностики; окончательным решением должна быть замена на качественно синтезированные и очищенные праймеры. |
| Для РНК: матрица загрязнена молекулами ДНК | Приготовьте РНК, используя другой метод/набор для выделения либо проведите обработку ДНКазой, а потом полностью инактивируйте/удалите её |
| В реакцию внесено слишком много матрицы | Для того, чтобы определить, какое количество матрицы необходимо для оптимальной работы вашей тест-системы проведите соответствующий эксперимент. Например, поставьте серию реакций, в которых количество матрицы отличалось бы в полтора или два раза между экспериментальными точками. |
| Слишком высокая концентрация праймеров | Проведите эксперимент с серией разведений праймеров для того, чтобы определить их оптимальную концентрацию для вашей тест-системы. |
| Амплификатор поддерживает неверную температуру полок во время термоциклирования | Почините/откалибруйте термоциклер либо воспользуйтесь другим прибором |
| Установлено чрезмерное количество циклов амплификации. | Как правило, для успешного прохождения ПЦР достаточно 20–35 циклов. Снизьте количество циклов до оптимального диапазона. |
| Слишком низкая температура отжига | В этом случае праймеры могут неспецифично связываться с матрицей. Оптимальная температура отжига, как правило, должна быть примерно на 5°C ниже температуры плавления (Tm) праймера. Рассчитайте Tm каждого праймера с помощью специализированного инструмента, например, онлайн-калькулятора. Для пары праймеров при расчёте температуры отжига ориентируйтесь на значение Tm праймера с наименьшим значением. Для большей точности оптимизируйте температуру отжига экспериментально, например, используя температурный градиент или амплификатор с независимыми термоблоками. |
| Слишком долгий отжиг | Избыточное время отжига может приводить к неспецифическому связыванию праймеров. Укоротите стадию отжига. Стандартная длительность этой стадии, как правило, составляет 30 секунд. |
| Слишком долгая элонгация | Избыточное время элонгации может приводить к неспецифической амплификации. Укоротите время элонгации, руководствуясь пропорцией: примерно 6 секунд на каждые 100 пар нуклеотидов ампликона (рекомендация для Taq-полимеразы; для других ферментов пропорция может отличаться). |
| Внесено слишком много ионов Mg2+ | Избыточная концентрация магния может приводить к неспецифическому связыванию праймеров и как следствие к наработке неспецифических продуктов ПЦР. Уменьшите концентрацию магния в ПЦР смеси. |
В. На геле видны шмеры
Рис. 1. Пример шмера. Целевой ампликон 2098 п.н. Снижение температуры отжига с 61 °C до 58 °C привело к неспецифической амплификации и образованию шмера (источник: Lorenz T.C., 2012, J Vis Exp, (63), e3998, doi:10.3791/3998). На данном рисунке показаны низкомолекулярные шмеры. Однако шмеры могут располагаться в геле как ниже, так и выше целевой полосы.
| Возможная причина | Решение |
| В реакцию внесено слишком много матрицы | Экспериментально подберите оптимальное количество вносимой матрицы, необходимое для качественной работы вашей тест-системы |
| Слишком много циклов ПЦР | Уменьшите количество циклов таким образом, чтобы их стало меньше 35 |
| Условия термоциклирования неоптимальны для вашего термоциклера | Оптимизируйте условия термоциклирования в соответствии с рекомендациями производителя термоциклера |
| Слишком низкая температура отжига | Подберите оптимальную температуру отжига экспериментально, увеличивая ее с шагом от 2 °C до 5 °C между двумя экспериментальными точками |
| Слишком высокая концентрация праймеров | Оттитруйте количество вносимых праймеров, выберите подходящую концентрацию праймеров для вашей тест-системы |
| Слишком долгое время элонгации | Подберите оптимальное время элонгации, уменьшая его небольшими шагами |
| Низкое качество ДНК | Используйте свежевыделенную ДНК или проведите повторное выделение другим методом/набором |
| В лунку геля внесено слишком много ДНК | Переставьте форез с меньшим количеством вносимой ДНК |
Г. На геле видны димеры праймеров
Рис. 2. Димеры праймеров (источник A Definitive, Practical Guide to Designing Primers for PCR & qPCR. | by Zwe Ye Htut (Ivan) | Medium)
| Возможная причина | Решение |
| Слишком высокая концентрация праймеров / добавлено слишком много праймеров | Оттитруйте количество вносимых праймеров, выберите подходящую концентрацию праймеров для вашей тест-системы |
| Праймеры обладают комплементарными перекрывающимися последовательностями. | Создавайте (или выберите) праймеры, не содержащие комплементарных последовательностей, особенно на 3′-концах. Повысьте температуру отжига. Используйте методику ПЦР с «горячим стартом» (hot-start PCR). |
Использованная литература:
- Troubleshooting PCR and RT-PCR Amplification (sigmaaldrich.com)
- PCR Troubleshooting | Bio-Rad
- Lorenz T.C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies // Journal of Visualized Experiments. 2012. № 63. e3998. doi:10.3791/3998. PMCID: PMC4846334. PMID: 22664923.