1.4.1.4. «Невидимые лучи». Эра ультрафиолетового излучения и бромистого этидия в визуализации данных электрофореза нуклеиновых кислот (1973–2010)

В отличии от трансиллюминаторов синего света и современных красителей эра ультрафиолета и бромистого этидия (Homidium bromide) наступила не в результате целенаправленного поиска и разработок новых методов молекулярной биологии, а благодаря ряду случайных совпадений. Оказалось, что ветеринарный препарат, производившийся в 1950х для обеспечения возможности эффективного разведения КРС в Африке к Югу от Сахары обладал побочным свойством — улучшал эффективность разделения кольцевой и линейной ДНК методом ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия (так он широко распространился в лабораториях). А также флуоресцировал в ультрафиолете.

Рисунок 1. Ветеринарный препарат Homidium bromide (бромистый этидий).

Как упоминалось ранее, в первой половине 20 века «невидимые лучи» — радиоактивное, рентгеновское и ультрафиолетовое излучение вызывали живой интерес даже среди обывателей, которые активно покупали ультрафиолетовые светильники для гостиной и ванной комнат, чтобы зарядится «живительной силой ультрафиолета».

Наблюдение за свечением объектов в ультрафиолете было популярно даже в качестве хобби и развлечения для детей (рисунок 2).

В науке в первой половине XX века ультрафиолетовое излучение широко использовались для стерилизации инструментов и люминесцентного анализа органических веществ, анализа минералов и руд. С его помощью проводили первые опыты по вызову мутаций и определяли концентрацию витаминов, нуклеиновых кислот и белков, обладающих естественным поглощением в УФ-диапазоне. Ультрафиолетовые лампы (как и счетчики Гейгера) выпускались промышленно и рекламировались даже на спичечных коробках (Рисунок 3).

Рисунок 2. Ультрафиолетовая лампа (бренд «Mineralight») 50-х годов для науки и хобби.

Рисунок 3. Реклама ультрафиолетовых ламп бренда Mineralight (производство компании UVP) и счетчиков гейгера на спичечном коробке. США, конец 1940х, начало 1950х годов.

Рисунок 4. Родохрозит в обычном свете и под ультрафиолетом.

Одним из первых производителей УФ-оборудования в мире для научных исследований стала компания Ultra-Violet Products (UVP), основанная Томом Уорреном в 1932 году. Изначально она фокусировалась на УФ-лампах для поиска флуоресцентных минералов (бренд «Mineralight»). Позже UVP начали выпускать оборудование для научных и промышленных целей, включая УФ-трансиллюминаторы и системы документирования гелей. В первой половине 20 го века компания бурно развивалась и открывала новые производственные и исследовательские центры (Рисунок 5).

Рисунок 5. Фотография из заметки в газете за 1951 год. Компания Ultra-Violet Products, Inc. открыла новый корпус для расширения разработок и производства в Южной Пасадене, штат Калифорния.

Таким образом, в то время ультрафиолетовые лампы были естественным выбором для визуализации флуоресценции. С другой стороны, впервые синтез бромистого этидия был описан в 1952 году ученым Н. Д. Уоткинсом (N. D. Watkins), а промышленный выпуск налажен британской компанией Boots Pure Drug Co., Ltd. под торговым названием Homidium (Ethidium^®). Реактив выпускался как ветеринарный препарат для лечения трипаносомоза крупного рогатого скота, который в первой половине XX века был огромной пороблемой для Африки. Его уникальное свойство — интеркаляция (способность встраиваться между парами оснований ДНК) — изначально было механизмом уничтожения паразитов: встраиваясь в митохондриальную ДНК трипаносом он менял ее конформацию и блокировал репликацию что вызывало гибель паразита.

Через десять лет после синтеза, 1960-х годах ученые обнаружили, что бромистый этидий не только интеркаллирует, но и флуоресцирует в ультрафиолтеовом свете, при этом при связывании с ДНК его флуоресценция усиливается в 20-100 раз. В 1966 году Le Pecq, J. B., & Paoletti, C. в своей публикации [A new fluorometric method for RNA and DNA determination. Analytical Biochemistry] предложили метод оценки концентрации ДНК основываясь на этом эффекте.

Одним из первых приложений бромистого этидия как реактива для молекулярной биологии стало разделение с его помощью топологических форм ДНК на основе эффекта интеркаляции. Ковалентно замкнутая кольцевая ДНК (сссDNA) связывает меньшее количество красителя по сравнению с никированной или линейной формами из-за топологических ограничений сверхспирализации. В конце 60х это различие в степени интеркаляции легло в основу метода препаративного выделения плазмидной и митохондриальной ДНК путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия (CsCl-EtBr) [Radloff, R., Bauer, W., & Vinograd, J. (1967). A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: The closed circular DNA in HeLa cells.]. Визуализация полос ДНК осуществлялась благодаря флуоресценции бромистого этидия в ультрафиолете: связавшийся с ДНК краситель светился оранжево-красным светом, позволяя непосредственно видеть и фиксировать положение полос кольцевой и линейной ДНК в центрифужной пробирке.

В визуализации данных электрофореза ДНК бромистый этидий, агарозный элетрофорез и ультрафиолет встретились в 1971 году, когда Aaij and Borst работали с митохондриальной ДНК и оценивали ее интактность методом центрифугирования в хлориде цезия/бромистом этидии (CsCl-EtBr).

В лаборатории сломалась центрифуга и эксперименты пришлось остановить. Исследователи были знакомы с пионерской работой H.V. Thorne относительно агарозного электрофореза кольцевой ДНК, однако, у них не было возможности ввести радиоактивные метки в свой препарат.

При этом в лаборатории оказались под рукой бромистый этидий (использовался для ультрацентрифугирования) и ультрафиолетовая лампа фирмы CAMAC. Исследователи добавили бромистый этидий в буфер для агарозного электрофореза, провели анализ и впервые визуализировали полосы ДНК в геле, меченные флуоресцентной краской. Результаты опубликовали в работе Aaij, C., & Borst, P. (1972). The gel electrophoresis of DNA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Nucleic Acids and Protein Synthesis, *269*(2), 192–200.

Так, изначально разработанный как ветеринарный препарат бромитсый этидий почти на без малого 50 лет стал основным реактивом для визуализации ДНК в агарозных гелях. А популярный то время ультрафиолет — основным источником света для трансиллюминаторов.

Судьба бромистого этидия и ультрафиолета в визуализации — это классический пример двойной технологической инертности. Если в ветеринарии его карьера закатилась в 80-х из-за биологической адаптации паразитов и токсичности, то в молекулярной биологии он застыл «в янтаре» до конца 2010-х. Благодаря случайному совпадению — способности флуоресцировать в коротковолновом УФ-диапазоне препарат из ветеринарной аптечки намертво привязал лаборатории к громоздким и опасным ультрафиолетовым трансиллюминаторам которые в свою очередь замедлили массовый переход на разработанные специально для молекулярной биологии высокочувствительные и менее токсичные красители, работающие в видимом спектре.

Развитие ультрафиолетовых трансиллюминаторов

Как только ученые поняли, что ДНК в геле можно заставить «светиться» в присутствии EtBr, возникла техническая задача: как удобно подсветить весь гель целиком.
Вначале использовали обычные ручные УФ-лампы (которыми проверяли минералы), направляя их на гель в темной комнате.

Рисунок 6. Ручная ультрафиолетовая лампа Mineralight модель SL 2537 Short Wave в кейсе модели 404. Произведена в 1957 году на заводе Ultra-Violet Products в Южной Пасадене, Калифорния. На кейсе видно открывающееся окошко, вероятно для направленного облучения объектов при закрытой крышке кейса.

Это было неудобно и давало неравномерное освещение. Поэтому для большего удобства пробовали применять кабинки с освещением геля сверху. Приборы представляли собой кожух, в верхней части которого были установлены УФ лампы. Для наблюдения за гелем сверху было специальное смотровое отверстие с мягким резиновым наглазником. По сути, это первый прообраз гель-документирующих систем. Такие приборы выпускают и используют до сих пор, например, для проверки купюр или обнаружения биологических следов, однако, для визуализации нуклеиновых кислот в гелях конструкция оказалась не оптимальна.

Рисунок 7. Прообраз первой гель-документирующей системы. UVP C-70G chromato- Vue UV Viewing Cabinet. Модель конца 80х, начала 90х годов. Подобные приборы стали массово применяться с конца 60х и с тех пор практически не изменились в дизайне.

Освещение сверху не обеспечивало высокой чувствительности, поэтому довольно быстро перешли к принципу «просвета» (Trans-illumination): Инженерная идея заключалась в том, чтобы поместить УФ-лампы под кварцевое стекло, на которое помещается гель. Свет проходит сквозь гель (транс-иллюминация), возбуждая краситель EtBr по всей его толщине геля, что делает полоски ДНК максимально яркими и четкими.

Рисунок 8. Ultra-Violet Products Chromato-Vue Transilluminator C-62. Один из первых в мире ультрафиолетовых трансиллюминаторов. Выпускался с середины 1970х годов на заводе фирмы UVP в г. Сан-Габриэль, Калифорния, США. Длина волны излучения — 254 нм.

Одной из первых компаний, сделавших УФ-трансиллюминаторы массовыми, стала американская UVP (Ultra-Violet Products). В 1970-х годах они выпустили специализированные «световые столы» со светофильтрами, отсекающими видимый свет, чтобы он не мешал видеть слабую флуоресценцию ДНК. С тех пор принципиальная конструкция трансиллюминаторов практически не менялась.

Кроме конструкции также шла эволюция по длине волны УФ излучения. Исследования показали, что EtBr поглощает ультрафиолетовый свет в трех областях.

• 254 нм (коротковолновый УФ): максимальный сигнал, но ДНК быстро разрушается.
• 302–312 нм (средневолновый): баланс между яркостью свечения и относительной, по сравнению с 254 нм сохранностью образца для дальнейшей работы.
• 365 нм (длинноволновый): еще выше сохранность образца, но свечение очень слабое.

В итоге золотым стандартом длины волны в УФ трансиллюминаторах стал средневолновой УФ свет с длиной волны 302-312 нм. В продвинутых моделях позже таже начали устанавливать второй источник ультрафиолета длиной волны 365 нм, для препаративных целей. Также были распространены трансиллюминаторы с дополнительным источником белого света, что было необходимо для визуализации гелей, окрашенных себером (для приложений где не хватало ограниченной чувствительности связки ультрафиолет-бромистый этидий).

Рисунок 9. Трансиллюминатор UVP UV Transilluminator Model LMW-20, год выпуска — 1998. Прибор мог излучать как видимый свет (для окраски ДНК серебрением), так и УФ свет длиной волны 312 нм (аналитический электрофорез) или 365 нм (более мягкое УФ излучение, для препаративных задач). Прибор уже комплектовался прозрачным защитным экраном (не показано на рисунке) для защиты оператора от УФ излучения.

По мере более широкого использования УФ трансиллюминаторов для визуализации гелей становилось все более очевидно, что они крайне опасны для глаз и кожи. Поэтому, чтобы снизить риски для персонала в дальнейшем УФ трансиллюминаторы обросли защитными экранами и закрытыми боксами (гель-документирующие системы). Кроме того, как правило, для работы с УФ трансиллюминатором и бромистым этидием выделяли отдельное помещение, чтобы сотрудники, которые не принимают непосредственное участие в визуализации не облучались ультрафиолетом и не контактировали с бромистым этидием.

Рисунок 10. Первые модели гельдокументирующих систем на основе ультрафиолетового и белого света. Слева гельдокументирующая система GDS 7500 на основе трансиллюминатора UVP WHITE/UV TMW-20 TRANSLUMINATOR, конец 90-х годов. Справа представлена модернизация этой системы начала 2000-х годов. В этот период компания UPV совершила технологический прорыв, начав устанавливать стандартные цифровые фотоаппараты вместо специализированных камер. Это решение позволило существенно удешевить систему, а за счет более высокого разрешения фотоаппаратов — значительно повысить качество снимков в сравнении с прежними промышленными камерами.

Рисунок 11. Гельдокументирующая система компании Biorad, Gel Doc XR+, выпускалась в период с 2008-2020 годы. Одна из последних моделей гельдокументирующих систем на основе ультрафиолета. Ознаменовала собой закат эры ультрафиолета в гельдокументации.

Постепенно ультрафиолетовые гельдокументирующие системы в погоне за чувствительностью росли в размерах. Система Gel Doc XR+ стала одной из последних знаковых моделей, работающих на основе ультрафиолетового излучения. Она занимала целый стол и ее уход с рынка ознаменовал завершение целой эпохи в молекулярной биологии.

Несмотря на десятилетия доминирования, УФ-трансиллюминаторы оказались своего рода «технологическим тупиком» в визуализации гелей. В сравнении с современными системами видимого (синего) спектра (например гель -документирующими системами SuperRay, APGENA GENOMICA, Россия), громоздкие ультрафиолетовые системы конца 2010х обладают критическими недостатками:

• Деструктивное воздействие: УФ-лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, повреждают ДНК, что критично при последующем клонировании фрагментов.
• Биологическая опасность: Работа с УФ требует жестких мер защиты (экраны, маски, перчатки) из-за риска тяжелых ожогов роговицы и кожи.
• Фотообесцвечивание: Длительная экспозиция ведет к быстрому выцветанию флуоресцентного сигнала, снижая качество документирования.
• Чувствительность: Проблема чувствительности стала непреодолимым барьером для ультрафиолетовой технологии. Увеличение яркости УФ-ламп для усиления сигнала лишь пропорционально увеличивало риски для оператора, повреждение и фотообесцвечивание образцов. В то время как яркость синих светодиодов (LED) можно было наращивать практически без негативных последствий.

Риунок 12. Начало заката эры ультрафиолетовых гигантов (слева). Справа — первый компактный гельдок синего света от компании Invitrogen (2011 год), обладавший сходной чувствительностью при гораздо более скромных габаритах.

Исторический парадокс заключается в том, что вся описанная выше эволюция УФ-визуализации — от первых ручных ламп UVP 60-х годов до систем Bio-Rad 2010-х — была продиктована случаем. Бромистый этидий, изначально разработанный как ветеринарный препарат против трипаносомозов, по чистой случайности оказался хорошим интеркалирующим агентом, чья флуоресценция возбуждалась именно в УФ-диапазоне.

В конце 1980-х — начале 1990-х годов молекулярная биология превратилась в активно развивающуюся отрасль. Этот прогресс позволил перейти к целенаправленным разработкам оборудования, изначально предназначенного для конкретных молекулярно-биологических задач.

В частности, начали разрабатываться и были созданы трансиллюминаторы синего света и современные флуоресцентные красители. Эти инновации ознаменовали постепенный закат эры использования ультрафиолета (УФ) и бромистого этидия (а также серебрения) для визуализации данных рутинного электрофореза нуклеиновых кислот, предложив более безопасную и чувствительную альтернативу. Тем не менее, в силу лабораторного консерватизма и приверженности старым протоколам, УФ-установки до сих пор продолжают использоваться во многих учреждениях.

Переход на синий свет официально поддерживается по двум направлениям: безопасность и результативность. Ведущие вузы (Harvard, MIT, Oxford) в своих инструкциях по охране труда требуют минимизировать использование УФ. В то же время гиганты индустрии (NEB, Thermo Fisher, Takara Bio) в протоколах по клонированию называют синий свет обязательным условием для защиты ДНК от повреждений, критических для лигировани.

Компания APGENA GENOMICA предлагает широкий выбор трансиллюминаторов/гель-документирующих систем на основе синего света. Преимуществами наших приборов является безопасность для оператора, низкий фоновый сингал, компактность и чувствительность недоступная ультрафиолетовым аналогам. Приборы разработаны и производятся в Москве.