1.2.3. Буфер для внесения проб в электрофорезе ДНК: состав, функции и выбор красителя-маркера

Данная статья посвящена ключевому вспомогательному реагенту для электрофореза — буферу для внесения проб (часто называемый загрузочным буфером). В материале подробно рассматриваются его основные функции, компонентный состав и стратегия выбора красителя-индикатора для контроля миграции ДНК в агарозном геле. В заключительной части приведены практические рецепты приготовления буферов.

Компания APGENA GENOMICA специализируется на предоставлении комплексных решений для агарозного гель-электрофореза. В ассортименте представлены современные реагенты, включая высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые гели и буферные системы, а также оборудование (такое как гель-документирующие системы синего света SuperRay для гель-документирования и препаративного выделения нуклеиновых кислот). Полный перечень продукции с техническими характеристиками доступен в нашем каталоге.

Буфер для внесения проб (также называемый загрузочным буфером, англ. gel-loading buffer) применяется для эффективного внесения образцов в лунки геля и, в случае наличия соответствующих красителей в составе буфера, для визуального контроля процесса электрофоретического разделения нуклеиновых кислот.

Перед загрузкой в лунку геля буфер смешивают с анализируемым образцом. Стандартно такие буферы изготавливаются или поставляются в 6-кратной концентрации (6х).

Основные функции буфера для внесения проб заключаются в следующем:

1. Повышение плотности образца. Это обеспечивает опускание образца на дно лунки, способствует его равномерному распределению по объёму, существенно замедляет диффузию образца из лунок во время загрузки.
2. Окрашивание препарата. Наличие красителя облегчает визуальный контроль процедуры внесения препарата в лунку.
3. Контроль хода электрофореза. Краситель, движущийся к аноду с известной скоростью, служит маркером. Его положение позволяет косвенно оценить миграцию разделяемых фрагментов ДНК и их текущее расположение в геле, что помогает своевременно остановить электрофорез и предотвратить выход целевых фрагментов («убегание» ДНК) из геля.

Состав буфера для внесения проб (загрузочного буфера)

Стандартный загрузочный буфер, как правило, представляет собой водный или буферный раствор, содержащий три ключевых компонента:

1. Один или несколько красителей-маркеров (например, бромфеноловый синий, оранжевый G или ксилолцианил FF) для визуализации.
2. ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), которая связывает ионы двухвалентных металлов. Это предотвращает их интерференцию с электрофорезом, а также ингибирует металлозависимые ферментативные реакции (например, деградацию ДНК нуклеазами).
3. Вещество, повышающее плотность раствора образца (сахароза, глицерин или фиколл). Это обеспечивает оседание образца на дно лунки и его равномерное распределение.

Сравнение компонентов, повышающих плотность раствора образца

• Сахароза и глицерин — традиционные компоненты. Глицерин обладает более высокой вязкостью, в то время как сахароза эффективнее увеличивает плотность. Важно: буферы на основе сахарозы и глицерина хранят в холодильнике.
• Глицерин может вызывать артефакты: его использование иногда приводит к образованию U-образных полос на геле, поскольку ДНК может «всплывать» по стенкам лунки до начала электрофореза. В TBE-гелях глицерин также способен взаимодействовать с боратом, что может локально изменять pH.
• Фиколл, хотя и менее распространен, обладает рядом преимуществ:
  • Способствует формированию более чётких и ярких полос по сравнению с глицерином и сахарозой.
  • Стабилен при комнатной температуре, что упрощает хранение и использование.

Красители в составе буферов для внесения проб: классификация и критерии выбора

При проведении агарозного гель-электрофореза используются два принципиально разных класса красителей. Во избежание путаницы важно их четко разграничить.

Первый класс — это красители для визуализации нуклеиновых кислот (например, бромид этидия, SafeGreen). Эти красители специфически связываются с молекулами ДНК или РНК, окрашивая их (как правило, флуоресцентно), и используются для детекции полос ДНК или РНК после окончания электрофореза с помощью трансиллюминатора. Они подробно описаны в разделе «Выбор красителя для визуализации нуклеиновых кислот» базы знаний.

Второй класс — красители-маркеры, входящие в состав загрузочного буфера. Обсуждение именно этого класса является целью данного раздела. Данные красители не связываются с нуклеиновыми кислотами и не предназначены для их визуализации в геле. Их основная функция — окрашивание раствора образца для облегчения манипуляций и контроля точности внесения пробы в лунку геля. Кроме того, будучи заряженными молекулами, эти красители, как и ДНК, мигрируют в электрическом поле к аноду (положительному электроду). Правильный подбор красителя по его электрофоретической подвижности позволяет косвенно, по положению окрашенной полосы красителя, оценить степень миграции целевых фрагментов ДНК от лунки до края геля и принять решение о необходимости остановки электрофореза.

Принцип выбора красителя-маркера

Ключевой критерий выбора — соотношение подвижности красителя и целевых фрагментов ДНК.

• Главное правило: краска должна мигрировать впереди (быстрее) анализируемых фрагментов.
• Критическое ограничение: следует избегать ситуаций, когда краситель движется со скоростью, сопоставимой со скоростью интересующей полосы ДНК. Например, если краситель мигрирует аналогично линейной двухцепочечной ДНК размером 300 пар оснований (п.о.), он непригоден для анализа фрагментов около 300 п.о., так как его полоса маскирует целевой фрагмент, что затрудняет анализ, особенно если речь идет о количественном анализе.

Таким образом, оптимальным является выбор такого красителя, который будет двигаться впереди исследуемых фрагментов, выступая в роли опережающего маркера.

Для обоснованного выбора красителя по его подвижности в геле рекомендуется ориентироваться на справочные данные, такие как эквивалентный размер ДНК (в п.о.) для конкретных условий электрофореза. В Таблице 1 приведен пример различий в подвижности для разных красителей на примере электрофореза в 1% агарозном геле. Однако, точная подвижность красителя зависит от типа агарозы, ее процентного содержания, состава буфера в котором проводится электрофорез.

Таблица 1. Положение красителя в 1% агарозном геле (download.ashx (ampliqon.com)

*точная подвижность красителя зависит от типа агарозы, ее процентного содержания, состава буфера в котором проводится электрофорез и может существенно отличаться от данных, приведенных в таблице

Рисунок 1. Результаты электрофореза ДНК-маркера с четырьмя загрузочными буферами в 1% агарозном геле. На фото представлен гель в белом и УФ-свете (из download.ashx (ampliqon.com))

Рисунок 2.Результаты электрофореза ДНК-маркера с четырьмя загрузочными буферами на 1% агарозном геле. Время электрофореза — 75 минут. (из download.ashx (ampliqon.com))

Примеры рецептов приготовления загрузочных буферов (буферов для внесения проб)

6х загрузочный буфер I (сахарозный)

1. 0.25% (вес/объем) ксиленцианол FF
2. 40% (вес/объем) водный раствор сахарозы
3. 0.25% (вес/объем) бромфеноловый синий

Хранить при температуре 4° С

(A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278)

6х загрузочный буфер II (сахарозный)

1. 40% (вес/объем) водный раствор сахарозы

2. 0.25% (вес/объем) бромфеноловый синий

Хранить при температуре 4° С

(Green MR, Sambrook J. Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.prot100404. PMID: 30602560.)

6х загрузочный буфер (на основе фиколла)

1. 0.25% (вес/объем) ксиленцианол FF
2. 15% (вес/объем) водный раствор фиколла 400
3. 0.25% (вес/объем) бромфеноловый синий

Хранить при комнатной температуре

(A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278)

6х загрузочный буфер (глицериновый)

1. 0.25% (вес/объем) ксиленцианол FF
2. 30% (вес/объем) водный раствор глицерина
3. 0.25% (вес/объем) бромфеноловый синий

Хранить при температуре 4° С

(Green MR, Sambrook J. Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.prot100404. PMID: 30602560.)

Щелочной загрузочный буфер

1. 300 мН NaOH
2. 6 мМ ЭДТА
3. бромкрезоловый зеленый (чда)
4. 18% (вес/объем) водный раствор фиколла 400
5. 0.25% (вес/объем) ксиленцианол FF

Хранить при температуре 4° С

Внимание: щелочной буфер используется только для проведения щелочного электрофореза (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambex. P 278).