1.6.3. Агарозный гель-электрофорез в пробоподготовке к NGS: оценка длины фрагментов ДНК (QC) и отбор фракций (Size Selection)

Данная статья рассматривает применение агарозного гель-электрофореза для контроля качества на ключевых этапах подготовки библиотек NGS. Основное внимание уделено оценке распределения фрагментов ДНК по длине и процедуре отбора фракций заданного размера (Size Selection). Также приведены практические рекомендации по проведению электрофореза и оценке качества готовых библиотек.

Компания APGENA GENOMICA специализируется на предоставлении комплексных решений для агарозного гель-электрофореза. В ассортименте представлены современные реагенты, включая высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые гели и буферные системы, а также оборудование (такое как гель-документирующие системы синего света SuperRay для гель-документирования и препаративного выделения нуклеиновых кислот). Полный перечень продукции с техническими характеристиками доступен в нашем каталоге.

Качество данных секвенирования нового поколения (NGS) критически зависит от этапов контроля на всех стадиях подготовки ДНК-библиотек. Вне зависимости от конкретной задачи — полногеномного секвенирования, анализа SNP, HLA-типирования или исследования транскриптома — оценка качества ДНК является обязательным условием для достижения оптимальных результатов.

На Рисунке 1 схематично представлены ключевые этапы приготовления NGS-библиотек с указанием стадий, после которых необходим контроль качества (QC Checkpoint). В данной статье основное внимание уделяется методам оценки длины фрагментов ДНК, отбору фракций заданного размера (Size Selection) и проверке качества амплифицированной библиотеки. Контроль качества ДНК после выделения рассмотрен в отдельной статье: 1.6.4. Агарозный гель-электрофорез для анализа качества геномной ДНК перед приготовлением NGS-библиотек.

Рисунок 1. Схематичное представление процесса приготовления ДНК-библиотек для NGS с указанием этапов контроля качества (QC Checkpoint). Источник: «NGS_QC_Guidance_for_Illumina_Workflows_20190502.docx», https://www.cdc.gov/labquality/qms-tools-and-resources.html

Хотя для контроля качества нуклеиновых кислот существуют автоматизированные системы электрофореза (например, Agilent Bioanalyzer® и TapeStation®), их применение сопряжено с высокими затратами на оборудование и расходные материалы. Кроме того, они могут иметь ограничения при анализе образцов с широким распределением фрагментов по длине. В то же время классический агарозный гель-электрофорез при корректной постановке обеспечивает точную оценку размера фрагментированной ДНК и позволяет выделить фракции нужной длины, что делает его экономически эффективным и универсальным инструментом для подготовки библиотек.

Агарозный гель-электрофорез для оценки длины фрагментов ДНК

Подготовка библиотеки для NGS включает фрагментацию ДНК до определённого размера (или отбор фракции из существующего пула), лигирование адаптеров и амплификацию. Качественно фрагментированная ДНК представляет собой набор фрагментов, распределение длин которых подчиняется закону Гаусса с максимумом в целевом диапазоне.

Неоптимальная фрагментация («недорезка» или «перерезка») может привести к значительному снижению информативности данных на этапе биоинформатического анализа, поскольку большая часть молекул окажется вне оптимума размеров. Идеальные библиотеки характеризуются узким распределением фрагментов относительно большой длины. Для максимизации полезного выхода данных за один цикл секвенирования длина фрагментов в библиотеке должна быть не меньше максимальной длины рида (прочтения) используемой платформы, что и объясняет важность точного контроля фрагментации (NGS: высокопроизводительное секвенирование / Д.В. Ребриков [и др.]; под общей редакцией Д.В. Ребрикова. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. – 232 с.: ил.; Uyaguari-Diaz, M.I., Slobodan, J.R., Nesbitt, M.J., Croxen, M.A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N.A., Tang, P. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015).

Стандартным методом оценки распределения фрагментов является электрофорез в геле — от классического и экономичного агарозного геля до специализированных приборных решений. Во всех случаях проводится параллельное разделение анализируемой библиотеки и маркера молекулярных масс с последующей интерпретацией положения полос или пиков. Если следующий этап протокола предполагает отбор фракции по размеру (Size Selection), то в случае агарозного электрофореза целевой участок геля просто вырезается.

Агарозный гель-электрофорез для отбора фракции заданного размера (Size Selection)

Некоторые протоколы подразумевают отбор фракции нужной длины непосредственно после фрагментации, другие — лигирование всего спектра полученных фрагментов. В любом случае этап Size Selection повышает эффективность секвенирования, снижает затраты и упрощает последующий анализ (Why Is It Important To Run Your NGS Gels Consistently? (bitesizebio.com). Более короткие, чем оптимальные, фрагменты дают слишком короткие риды, а более длинные могут искажать результаты.

Для обеспечения воспроизводимости результатов рекомендуется:

• Использовать агарозу одной и той же марки (указанной в протоколе или предварительно подобранной).
• Тщательно контролировать концентрацию агарозы, учитывая потери воды при кипячении (взвешиванием до и после нагревания и добавление горячей деионизованной воды чтобы компенсировать испарение), так как это напрямую влияет на селекцию по размерам.
• Соблюдать единые условия электрофореза (время, напряжение, температура), определяющие конечный результат.
• В лабораториях часто используют буферы TBE или TAE. TBE менее склонен к перегреву, однако борат в его составе препятствует выделению ДНК из геля и может ингибировать последующие ферментативные реакции, поэтому для селекции по размерам в NGS рекомендован TAE-буфер.

После электрофореза целевой участок геля, соответствующий нужному диапазону длин, вырезается скальпелем или специальной одноразовой насадкой для пипетки, что обеспечивает большую воспроизводимость по сравнению с ручной резкой. Затем ДНК элюируют из геля с использованием соответствующих наборов для экстракции с последующей очисткой, например, на спин-колонках (NGS: высокопроизводительное секвенирование / Д.В. Ребриков [и др.]; под общей редакцией Д.В. Ребрикова. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014. – 232 с.: ил.; Agarose Gel Size Selection for DNA Sequencing Libraries. Elaine Mardis and W. Richard McCombie. Cold Spring Harb Protoc; 2017; doi:10.1101/pdb.prot094698; Why Is It Important To Run Your NGS Gels Consistently? (bitesizebio.com)).

В качестве страховки рекомендуется вырезать несколько полос геля для возможности возврата к образцу в случае неудачи на следующих этапах (Why Is It Important To Run Your NGS Gels Consistently? (bitesizebio.com).

Ожидаемый результат успешного отбора требуемой фракции библиотеки (Size Selection): на электрофореграмме должна наблюдаться одна чёткая полоса ожидаемого размера без размытия или значительного уширения (см. Рисунок 2).

Рисунок 2. Изображения библиотек ДНК на геле (A) Библиотеки ДНК после ПЦР до size selection и (B) библиотеки ДНК, после size selection (целевой диапазон: 500-800 п.н.). Рисунок из статьи «Uyaguari-Diaz, M. I., Slobodan, J. R., Nesbitt, M. J., Croxen, M. A., Isaac-Renton, J., Prystajecky, N. A., Tang, P. Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples. J. Vis. Exp. (98), e52685, doi:10.3791/52685 (2015)»

Агарозный гель-электрофорез для оценки качества ДНК-библиотеки после амплификации

Перед объединением библиотек и загрузкой в секвенатор для достижения оптимальной плотности кластеров необходима количественная и качественная оценка библиотек. Количественная оценка библиотек проводится с помощью флуориметрии или количественной ПЦР (например, KAPA qPCR). Для оценки распределения фрагментов библиотеки по размерам можно провести стандартный агарозный гель-электрофорез. На геле также можно визуализировать такие артефакты, как димеры праймеров и низкомолекулярную РНК-контаминацию, которые проявляются в виде «шмера» (NGS Library Quantification and Quality Control | Biocompare Bench Tips).

Ожидаемые результаты: концентрация библиотеки в требуемом в соответствии с вашим протоколом диапазоне. На геле должна присутствовать одна чёткая полоса целевого размера без размытия и неспецифических продуктов (димеров праймеров, РНК контаминации).