1.3.1 Критерии выбора концентрации агарозы для электрофоретического разделения фрагментов ДНК
Влияние концентрации агарозы на электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
Концентрация агарозы в геле является критическим параметром, определяющим подвижность и эффективность разделения фрагментов нуклеиновых кислот. Её выбор напрямую зависит от размеров анализируемых фрагментов.
Определение и рабочий диапазон
Концентрация агарозы рассчитывается как процентное отношение массы сухого порошка к объёму буфера. Стандартный рабочий диапазон составляет от 0,2% до 3% (Smith, 1993). Наиболее часто в лабораторной практике применяют гели с концентрацией 0,8–1,5%.
Практический выбор концентрации
Принцип выбора основан на обратной зависимости между размером пор геля и концентрацией агарозы:
- Для разделения крупных фрагментов ДНК (например, >10 тыс. пар оснований) используют гели с низкой концентрацией (0,3–0,5%), обладающие крупными порами.
- Для эффективного разделения небольших фрагментов ДНК (например, <1 тыс. пар оснований) требуются гели с высокой концентрацией (1–1,5%), которые формируют более мелкую поровую сетку.
Компромиссы при выборе концентрации
Выбор концентрации сопряжён с рядом практических нюансов:
- Гели с высокой концентрацией агарозы (1,5–3%) часто обладают пониженной прозрачностью, что может затруднять визуализацию результатов.
- Гели с низкой концентрацией агарозы (0,2–0,5%) являются хрупкими и непрочными, что осложняет последующее обращение с ними.
Физико-химическая основа: структура геля и математическая модель
Агарозный гель представляет собой трёхмерную сетку из переплетённых полимерных цепей, стабилизированных водородными связями. Под действием электрического поля молекулы ДНК перемещаются через поры этой сетки. Линейная зависимость логарифма электрофоретической подвижности ДНК (µ) и концентрации геля (ɩ) описывается выражением:
logµ = logµ0 — Kr ɩ
где logµ0 — свободная электрофоретическая подвижность ДНК в отсутствие геля, Kr — коэффициент ретардации, зависящий от свойств геля, а также размеров и формы молекулы (Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.top100388. PMID: 30602561; Поляничко А.М. (2007) Электрофорез в ПААГ. Учебно-методическое пособие, СПбГУ, 72 с. (PDF).
Соответствие размера фрагментов линейной ДНК и процентного содержания агарозы представлено в таблице 1 (из S. Magdelin — Gel Electrophoresis — Principles and Basics [biochem] (2012, Intech )).
Нижний предел эффективного разделения размеров ДНК в основном определяется диффузией полосы в геле. Хотя в гелях с низкой концентрацией агарозы небольшие фрагменты ДНК и разделяются, достигаемая при этом чёткость полос является невысокой.
Верхний предел разделения находится в прямой зависимости от напряжённости электрического поля, применяемого при электрофорезе. Чем ниже напряжённость поля, тем эффективнее можно разделить более длинные молекулы ДНК с большей молекулярной массой (Метод электрофореза ДНК в агарозном геле. — ОФС.1.7.2.0039.18. — Общая фармакопейная статья. — Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание.- М.: 2018 год).
В случае работы с нестандартными разновидностями агарозы рекомендации по соответствию её концентрации размеру фрагментов ДНК имеют особенности и приведены в таблице 2 (из Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jan 2;2019(1). doi: 10.1101/pdb.top100388. PMID: 30602561.).
Таблица 1. Концентрация агарозы, подходящая для разделения фрагментов ДНК различных размеров
| Агароза (%) | Размер фрагментов линейной ДНК (кб) |
|---|---|
| 0.2 | 5-40 |
| 0.4 | 5-30 |
| 0.6 | 3-10 |
| 0.8 | 1-7 |
| 1.0 | 0.5-5 |
| 1.5 | 0.3-3 |
| 2 | 0.2-1.5 |
| 3 | 0.1-1 |
Таблица 2. Концентрация разных типов агароз, подходящая для разделения фрагментов ДНК различных размеров
| Диапазон размеров фрагментов ДНК к различным типам агарозы | ||||
|---|---|---|---|---|
| Агароза (%) | стандартная | с высокой прочностью геля | легкоплавкая | легкоплавкая с низкой вязкостью |
| 0.3 | ||||
| 0.5 | 700 п.о. — 25 кб | |||
| 0.8 | 500 п.о. — 15 кб | 800 п.о. — 10 кб | 800 п.о. — 10 кб | |
| 1.0 | 250 п.о. — 12 кб | 400 п.о. — 8 кб | 400 п.о. — 8 кб | |
| 1.2 | 150 п.о. — 6 кб | 300 п.о. — 7 кб | 300 п.о. — 7 кб | |
| 1.5 | 80 п.о. — 4 кб | 200 п.о. — 4 кб | 200 п.о. — 4 кб | |
| 2.0 | 100 п.о. — 3 кб | 100 п.о. — 3 кб | ||
| 3.0 | 500 п.о. — 1 кб | 500 п.о. — 1 кб | ||
| 4.0 | 100 п.о. — 500 п.о. | |||
| 6.0 | 10 п.о. — 100 п.о. | |||
На рисунке 1 показано влияние концентрации агарозного геля на подвижность фрагментов ДНК (из 2001_Ausubel_Current Protocols in Molecular Biology_Agarose Gel Electrophoresis;).
 | |
| log10 длины молекулы ДНК, кб |  |
подвижность, см |
Рисунок 1. Влияние концентрации агарозного геля на подвижность фрагментов ДНК, где по оси X показана мобильность в см, а по оси Y log10 длины молекулы ДНК, кб
Для разделения фрагментов ДНК размером более 25 кб традиционный агарозный гель-электрофорез не подходит — в этом случае используют метод электрофореза в агарозном геле в импульсном поле (pulsed-field agarose gel electrophoresis). С его помощью можно разделять фрагменты ДНК размером от ∼10 до более 2000 кб. Фрагменты ДНК размером менее 100 п.н. эффективнее разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. 2012 Apr 20;(62):3923. doi: 10.3791/3923. PMID: 22546956; PMCID: PMC4846332).
Для разделения фрагментов размером менее 100 п.н. также может успешно применяться агароза с высоким уровнем разрешения (high-resolution agarose). Она подходит для анализа небольших фрагментов нуклеиновых кислот и продуктов ПЦР в диапазоне от 20 до 1000 пар оснований. Эта разновидность агарозы, в частности, доступна в каталоге APGENA GENOMICA.
Для самостоятельного приготовления агарозного геля необходимой процентности используется следующая формула:
% геля (масса/объём) = (масса агарозы (г) / объём буфера (мл)) × 100%
Компания APGENA GENOMICA предоставляет полный спектр решений для агарозного гель-электрофореза, включая современные реактивы (высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые агарозные гели, буферные системы) и оборудование. В частности, системы SuperRay предназначены как для высокочувствительного гель-документирования, так и для препаративного выделения нуклеиновых кислот из геля. С подробным описанием продукции можно ознакомиться в нашем каталоге по этой ссылке.