1.5.3. Как модификации и последовательность ДНК влияют на прохождение агарозного гель-электрофореза
Согласно основному принципу электрофореза, подвижность нуклеиновых кислот в геле зависит от их длины: более длинные фрагменты ДНК мигрируют медленнее, чем короткие, а фрагменты одинаковой длины должны перемещаться с одинаковой скоростью.
Однако, это не совсем и не всегда так. Нуклеиновые кислоты с равным количеством нуклеотидов, но разной последовательностью или конформацией могут демонстрировать различную электрофоретическую подвижность. Данный эффект касается не только агарозного электрофореза, но и проявляется в полной мере также при проведении электрофореза в полиакриламидных гелях, а также в капиллярном электрофорезе. Для описания этого свойства некоторые исследователи вводят понятие «размер» фрагмента ДНК, который не всегда прямо соответствует его длине в парах оснований. Это особенно заметно при анализе плазмидной ДНК, где конформационные различия существенно влияют на миграцию в геле. (Bring on the EtBr: How Can I Be Sure My Gel Reflects My Sample? | VectorBuilder).
Влияние последовательности ДНК на электрофоретическую подвижность
Фрагменты ДНК, богатые AT-основаниями, могут мигрировать медленнее, чем фрагменты, обогащённые GC-основаниями, при одинаковой длине. Этот эффект особенно заметен при электрофорезе с высоким разрешением (Troubleshooting Guide for DNA Electrophoresis // www.fermentas.com).
Влияние модификации ДНК на электрофоретическую подвижность
Ковалентные модификации ДНК, такие как метилирование, биотинилирование или присоединение крупных флуоресцентных меток, также приводят к снижению электрофоретической подвижности по сравнению с немодифицированной ДНК той же длины (Troubleshooting Guide for DNA Electrophoresis // www.fermentas.com).
Влияние конформации ДНК на прохождение агарозного электрофореза
Конформация молекулы ДНК является ключевым фактором, определяющим её электрофоретическую подвижность. Для линейных фрагментов скорость миграции в агарозном геле обратно пропорциональна логарифму их молекулярной массы, что в графическом представлении даёт линейную зависимость. В отличие от линейных форм, кольцевые (циркулярные) молекулы ДНК ведут себя иначе. Их подвижность определяется в первую очередь компактностью конформации при движении через поры геля.
Как правило, хотя и не всегда, наиболее быстро мигрируют высококомпактные суперспирализованные (сверхспиральные) формы, за ними следуют линейные молекулы, а наименьшей подвижностью обладают открытые кольцевые (никированные) формы с одноцепочечным разрывом.
Рисунок 1. Результат агарозного гель-электрофореза плазмидной ДНК: кольцевая (нативная) форма (левая дорожка) и линеаризованная форма, полученная рестрикцией по уникальному сайту (правая дорожка).
Плазмидная ДНК служит наглядным примером: одна и та же последовательность в разных конформациях занимает на геле различные положения. Например, никированная плазмида (форма II) остаётся кольцевой, но, как правило, мигрирует очень медленно; линеаризованная форма (форма III) движется быстрее, а интактная ковалентно замкнутая кольцевая ДНК (кзкДНК, форма I) — ещё быстрее.
Относительная подвижность трех форм зависит в первую очередь от концентрации и типа агарозы, используемой для приготовления геля, но на неё также оказывают влияние напряжение электрофореза, ионная сила буфера, плотность сверхспиральных витков у ДНК формы I. В некоторых условиях ДНК формы I мигрирует быстрее, чем ДНК формы III, при других условиях ситуация может изменится на противоположную. Поэтому для чёткого различения конформационных форм на практике рекомендуется параллельно анализировать на геле исходный кольцевой препарат и образец, линеаризованный рестриктазой с единственным сайтом рестрикции (Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by Agarose Gel Electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc. 2019).
Интересно что даже в пределах ковалентно замкнутой кольцевой ДНК существует конформационное разнообразие. Суперспирализованная ДНК может существовать в виде положительных или отрицательных сверхспиралей. При этом положительные суперспирали обладают несколько большей компактностью, что обуславливает их более высокую скорость миграции по сравнению с отрицательными. (Bring on the EtBr: How Can I Be Sure My Gel Reflects My Sample? | VectorBuilder).
 |  |
Рисунок 2. Электрофорез плазмидной ДНК (4180 п.о.) после различных обработок (Bring on the EtBr: How Can I Be Sure My Gel Reflects My Sample? | VectorBuilder).
Дорожки геля:
- Необработанный образец: Смесь конформаций плазмиды.
- Обработка экзонуклеазой Т5: Образец, очищенный от никированной и линеаризованной ДНК; представлена преимущественно ковалентно замкнутая кольцевая ДНК (cccДНК/кзкДНК).
- Обработка никазой: Фермент создаёт одноцепочечные разрывы, превращая плазмиду в никированную (открытую кольцевую) форму.
- Обработка рестриктазой: Фермент с единственным сайтом рестрикции линеаризует плазмиду.
При повышении концентрации агарозы (до 4%) миграция никированной формы ДНК практически прекращается. В то же время скорость движения линеаризованной ДНК хотя и снижается, остаётся значительной. Таким образом, агарозный электрофорез позволяет эффективно разделять линеаризованную и никированную ДНК одинаковой молекулярной массы благодаря разнице в их подвижности. Этот же подход можно использовать для контроля целостности препарата плазмидной ДНК после выделения, что особенно важно для последующих экспериментов, например трансфекции, где необходима интактная сверхспиральная форма ДНК. (Aaij C, Borst P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim Biophys Acta. 1972 May 10;269(2):192-200. doi: 10.1016/0005-2787(72)90426-1. PMID: 5063906.).
Влияние бромистого этидия на конформацию ДНК
Бромистый этидий (EtBr) способен влиять на результаты электрофореза благодаря своему взаимодействию с ДНК. Присутствие этого красителя снижает подвижность линейных дуплексов, а на замкнутые кольцевые молекулы ДНК воздействует особенно сильно. Бромистый этидий изменяет плотность упаковки суперспиральных ковалентно замкнутых кольцевых молекул, превращая их в положительные суперспирали. При увеличении концентрации бромистого этидия отрицательные суперспирали постепенно устраняются, что приводит к снижению подвижности ДНК. Этот процесс продолжается до достижения критической концентрации свободного красителя, при которой отрицательные суперспиральные витки полностью исчезают. Последующее увеличение концентрации молекул бромистого этидия приводит к образованию положительных суперспиральных витков, которые, подобно отрицательным, увеличивают электрофоретическую подвижность молекул. Таким образом, проводя электрофорез в гелях с разными концентрациями бромистого этидия, можно эффективно разделять топоизомеры ДНК, в частности, выделять ковалентно замкнутые кольцевые формы (форма I) среди других конформаций. (Asubel/ Resolution and recovery of large section ii DNA fragments. Current Protocols in Molecular Biology // 2000. — 2.5A.1-2.5A.9).
Влияние бромистого этидия на результаты электрофореза можно исключить, применяя современные неинтеркалирующие красители либо проводя окрашивание геля уже после завершения электрофореза.
Сравнение электрофореза малых плазмид, проведённого в геле с добавлением EtBr, с анализом тех же плазмид в геле без красителя показывает, что разница в подвижности линеаризованной и ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (кзкДНК) незначительна. Однако никированные плазмиды в присутствии бромистого этидия мигрируют быстрее, что, вероятно, связано с интеркаляцией красителя, уплотняющей их конформацию.
Для более крупных плазмид взаимодействие с бромистым этидием приводит к гораздо более выраженным различиям в подвижности (см. рис. 3). Это важно учитывать, поскольку «золотым стандартом» высококачественной препаративной плазмиды является сверхспиральная ДНК, которая в геле обычно соответствует самой нижней (быстрее всего мигрирующей) полосе. (Bring on the EtBr: How Can I Be Sure My Gel Reflects My Sample? | VectorBuilder).
Рисунок 3. Сравнение результатов электрофореза малой (А) и крупной (Б) плазмид в агарозном геле при разных методах окрашивания бромистым этидием (внесение в гель и после электрофореза) и различных обработках образцов.
Обозначения дорожек: 1 — необработанная плазмида; 2 — плазмида, обработанная экзонуклеазой Т5; 3 — плазмида, обработанная никазой; 4 — плазмида, линеаризованная рестриктазой.
Компания APGENA GENOMICA предлагает комплексные решения для агарозного гель-электрофореза, включающие:
- Реактивы: современные высокочувствительные красители, таблетированную и высокоразрешающую агарозу, готовые агарозные гели, буферы (TAE, TBE).
- Оборудование: высокочувствительные системы для гель-документирования и препаративного выделения нуклеиновых кислот из гелей SuperRay.
С полным ассортиментом продукции можно ознакомиться в нашем каталоге.