1.5.2. Артефакты при электрофорезе в агарозном геле: механизмы возникновения и методы идентификации на примере анализа вариантов сплайсинга

Несмотря на широкое применение агарозного гель-электрофореза для анализа нуклеиновых кислот, интерпретация результатов может осложняться появлением артефактных полос. Эта проблема особенно актуальна при разделении частично гомологичных последовательностей, таких как альтернативные варианты сплайсинга

Показано, что вероятность появления артефактов может зависеть от условий проведения электрофореза. В частности, в исследовании «Appearance of ghost bands in gel electrophoresis depending on agarose concentration» описано, что при разделении сплайсинг-вариантов в 2,2% агарозном геле наблюдались дополнительные полосы, которые не выявлялись при использовании геля с концентрацией агарозы 1%. (Raab J, Fink B, Bauer M. Appearance of ghost bands in gel electrophoresis depending on agarose concentration. Electrophoresis. 2023 Aug;44(15-16):1206-1209. doi: 10.1002/elps.202300041. Epub 2023 May 31. PMID: 37259607).

Как проверить истинная ли полоса или это артефакт?

Чтобы отличить истинный вариант сплайсинга от артефакта, в первую очередь оценивают электрофоретическую подвижность полосы относительно ожидаемых продуктов. При стандартном электрофорезе продуктов ПЦР в агарозном геле наличие дополнительной полосы ДНК, расположенной между полосами ДНК двух ожидаемых вариантов сплайсинга, скорее указывает на артефактную полосу ДНК.

Для надежной идентификации нуклеотидной последовательности подозрительные полосы ДНК вырезают из геля, очищают, клонируют в плазмидный вектор и трансформируют в бактерии. Затем проводится контрольная ПЦР и анализ полученных продуктов.

Возможные причины возникновения полос-артефактов

В статье «Appearance of ghost bands in gel electrophoresis depending on agarose concentration» проводился анализ экзона, в котором могут присутствовать разные варианты сплайсинга. При анализе в 1% агарозном геле исследователи получили 2 ожидаемые полосы ДНК длиной 108 п.о. и 489 п.о. (рис. 1А, верхняя часть) а при анализе в 2,2% агарозном геле для тех же образцов появились наряду с ожидаемыми еще три дополнительные полосы размером около 350, 370 и 550 п.о.

Рисунок 1. Результаты электрофореза в агарозном геле.

Подозрительные полосы были вырезаны из геля и проанализированы, как описано выше. Удивительно, но контрольная ПЦР для полосы ДНК длиной около 350 п.о. не дала продукта аналогичной длины ни в одном из экспериментов (рис. 1B, нижняя часть). Вместо ожидаемого продукта ПЦР размером 350 п.о. плазмиды содержали вставки длиной 108 п.о., либо 489 п.о. Это первый признак присутствия полосы-артефакта, предположительно представляющей собой продукт гибридизации между гомологичными участками одиночных цепей вариантов сплайсинга длиной 108 и 489 п.о. Напротив, ПЦР для вставки размером 550 п.о. дала ожидаемый продукт аналогичной длины. Анализ последовательности выявил новый вариант сплайсинга длиной 551 п.о., состоящий из всей последовательности полосы длиной 489 п.о., с дополнительной последовательностью.

Для подтверждения гипотезы о появлении артефактных полос в результате гибридизации частично гомологичных вариантов сплайсинга было исследовано появление таких полос в смесях одиночных продуктов ПЦР из плазмидной ДНК в неденатурирующих условиях при электрофорезе в стандартном агарозном геле и их исчезновение в денатурирующих условиях при электрофорезе в денатурирующем, щелочном агарозном геле.

Независимо от концентрации агарозы, в отсутствии предварительной денатурации ПЦР продуктов при проведении стандартного не денатурирующего агарозного электрофореза артефактные полосы не образовывались (рис. 1C, верхняя и средняя части). Однако в случае предварительной денатурации смеси ПЦР продуктов при 94°С в течение 5 мин (для получения одноцепочечной ДНК) в ходе последующего проведении стандартного неденатурирующего агарозного электрофореза образовывались артефактные полосы длиной около 350 и 370 п.о. соответственно, но только при анализе в геле с высокой концентрацией агарозы (2,2% или выше, рисунок 1C, средняя часть).

Напротив, при денатурирующем электрофорезе в щелочном агарозном геле (2,2%) артефактные полосы из тех же предварительно термически денатурированных смесей ПЦР продуктов не образовывались (рис. 1C, нижняя часть). Это убедительные доказательства образования дополнительных продуктов гибридизации между частично гомологичными одноцепочечными фрагментами ДНК, дающими артефактные полосы. При этом в статье указывается, что не для всех последовательностей артефактные полосы возникают только в гелях с высокой концентрацией агарозы.

Состав артефактной полосы можно приблизительно предсказать: например, артефактная полоса длиной около 350 п.о. (700 нуклеотидов), по-видимому, состоит из одной одиночной цепи ДНК длиной 489 п.о. (489 нуклеотидов) и двух одиночных цепей ДНК длиной 108 п.о. (216 нуклеотидов).

Однако для выявления истинной причины более частого возникновения артефактных полос в гелях с высокой концентрацией агарозы требуются дополнительные исследования.

Компания APGENA GENOMICA предоставляет полный спектр решений для агарозного гель-электрофореза, включая современные реактивы (высокочувствительные красители, агарозы различных типов, готовые агарозные гели, буферные системы) и оборудование. В частности, системы SuperRay предназначены как для высокочувствительного гель-документирования, так и для препаративного выделения нуклеиновых кислот из геля.

С подробным описанием продукции можно ознакомиться в нашем каталоге