1.6.2. Препаративный и аналитический агарозный гель-электрофорез

Агарозный электрофорез применяется в аналитических и/или препаративных целях. Аналитический электрофорез используется для разделения фрагментов нуклеиновых кислот с целью их последующей визуализации и анализа. Препаративный электрофорез служит для разделения фрагментов с последующим выделением целевых фракций из геля.

Примеры применения аналитического агарозного гель-электрофореза

1. Контроль качества и измерение концентрации продуктов ПЦР-амплификации перед постановкой реакции секвенирования по Сэнгеру.
2. Траблшутинг (поиск причин возникновения проблем при прохождении простой ПЦР, реакции секвенирования по Сэнгеру, ПЦР в реальном времени).
3. Контроль качества геномной ДНК перед подготовкой NGS-библиотек.
4. Оценка длины фрагментов ДНК как этап рабочего процесса подготовки NGS-библиотек.
5. Оценка длины полученного ПЦР-продукта (например, на этапе отработки методики qPCR). Может проводиться в автоматическом режиме с помощью программного обеспечения GelAnalyzer 23.1.1.
6. Генотипирование ДНК. В этом случае агарозный электрофорез является финальным этапом. Информация о генотипе извлекается на основе анализа наличия/отсутствия и длины полос в геле.
   • Анализ инсерций-делеций. Например, анализ (I/D) полиморфизма гена ACE.
   • Анализ однонуклеотидных полиморфизмов. Например, анализ полиморфизма R577X гена ACTN3 методом ПДРФ (RFLP).

1. Качественный анализ наличия или отсутствия ДНК-мишени в образце (yes/no). Например, детекция патогена в биологическом образце методом ПЦР-амплификации целевой ДНК с последующей визуализацией результата. Другим примером является скрининг колоний в рабочем процессе молекулярного клонирования.
2. Определение концентрации фрагментов ДНК, например, ПЦР-продуктов, путём сравнения интенсивности свечения полос маркера молекулярных масс с известной концентрацией и исследуемых полос.

Для проведения количественного анализа эффективно применяются системы гель-документации SuperRay в связке со специализированным программным обеспечением GelAnalyzer 23.1.1, которое автоматизирует расчёты.

Ключевые преимущества подхода:

• Равномерное освещение: Светодиодная панель SuperRay обеспечивает однородную подсветку геля, что критически важно для получения достоверных данных.
• Высокая чувствительность: Совместимость прибора с современными флуоресцентными красителями позволяет детектировать и анализировать полосы ДНК низкой концентрации, часто невидимые при использовании стандартных УФ-трансиллюминаторов.

Примеры применения препаративного агарозного гель-электрофореза

1. Очистка продуктов ПЦР от неспецифических продуктов и/или димеров праймеров перед проведением реакции секвенирования по Сэнгеру.
2. Селекция ДНК по размеру после фрагментации перед подготовкой NGS-библиотек.
3. Выделение высокомолекулярной фракции ДНК из тотальной геномной ДНК для последующей подготовки NGS библиотек.
4. Очистка линеаризованной формы вектора при клонировании ДНК от никированной и кольцевой форм, а также очистка вставки для молекулярного клонирования.

Важные моменты при постановке препаративного электрофореза

1. Выбор буфера: Рекомендуется использовать 1x Трис-ацетатный буфер (ТАЕ) (A Handbook for Gel Electrophoresis. Cambrex. P. 278). TBE-буфер не рекомендован, так как содержащийся в нём борат негативно влияет на эффективность выделения ДНК из геля, а также сильно ингибирует такие ферменты, как ДНК-лигазы и полимеразы. Это снижает эффективность последующих манипуляций с выделенной ДНК.
2. Выбор красителя: Краситель должен быть совместим с используемым трансиллюминатором, обеспечивать высокую чувствительность детекции и не препятствовать последующим процедурам, таким как ферментативные реакции (лигирование, ПЦР) или секвенирование. Для препаративных целей предпочтительны интеркалирующие красители, которые легко удаляются из ДНК в процессе выделения, в отличие от красителей, прочно связывающихся с ДНК и ингибирующих ферменты. Компания APGENA GENOMICA предлагает широкий выбор таких красителей. С каталогом красителей можно ознакомится по этой ссылке (ссылка https://apgena.ru/product-category/catalog/reagents/krasiteli-dlja-jelektroforeza/)
3. Визуализация и вырезание полос:
   • После проведения электрофореза гель помещают на трансиллюминатор и вырезают целевые полосы скальпелем. Вырезанные фрагменты геля помещают в заранее промаркированные пробирки.
   • При работе с ультрафиолетовыми трансиллюминаторами краситель под воздействием УФ-излучения быстро выгорает, и полосы тускнеют, поэтому работать необходимо быстро. При необходимости гель можно дополнительно окрасить в течение 15–30 минут в ванночке с красителем и продолжить вырезание, однако это может привести к снижению разрешения из-за диффузии полос.
   • При работе на УФ-трансиллюминаторе важно обеспечить защиту глаз и кожи, так как воздействие УФ-излучения может вызвать ожоги. Также важно минимизировать его воздействие на ДНК, так как это приводит к повреждениям ДНК, снижающим эффективность последующих процедур.

Рекомендуемое решение для препаративных работ

Для процедуры препаративного выделения фрагментов ДНК из агарозного геля мы рекомендуем использовать систему гель-документации SuperRay (APGENA GENOMICA, Россия). Её ключевые преимущества включают:

— Безопасная визуализация: Использование синего света (длина волны 465 ± 20 нм) исключает повреждение ДНК, не вызывает выгорания красителя и полностью безопасно для оператора.

— Специализированная оснастка: Система комплектуется специальной доской из закалённого стекла для резки гелей, которая устойчива к царапинам, не нагревается и легко моется.

Высокая чувствительность: SuperRay в сочетании с современными красителями позволяет детектировать и вырезать полосы ДНК очень низкой концентрации, часто невидимые на стандартных УФ-трансиллюминаторах.

1. Извлечение ДНК из геля: для извлечения ДНК из геля могут применяться различные методы: элюция буферными растворами, центрифугирование, циклы замораживания-оттаивания. Хотя соответствующие протоколы хорошо описаны, рекомендуется использовать готовые коммерческие наборы для выделения ДНК из агарозных гелей. Как правило, такие наборы проходят длительную оптимизацию и обеспечивают более высокую стабильность, качество и выход целевого продукта по сравнению с внутрилабораторными протоколами.

Для того, чтобы ознакомиться с нашими решениями для агарозного электрофореза, перейдите в наш каталог.